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Communications Biology volume 6、記事番号: 572 (2023) この記事を引用

684 アクセス

11 オルトメトリック

メトリクスの詳細

実験用マウスは、哺乳類の中枢神経系の生理学の基礎に多大な洞察をもたらしました。近年、頭蓋窓と組み合わせた頭部固定標本を使用して、生きた脳の局所的な活動ネットワークを研究することで、生体内で単一のニューロン、グリア、血管細胞を画像化することが可能になりました。このようなアプローチは、全身麻酔を使用せずに成功し、中枢神経系の自然な挙動についての洞察を提供します。しかし、常に動いている目については、同じことがまだ開発されていません。今回我々は、覚醒行動マウスの単細胞レベルでの高解像度補償光学網膜イメージングを可能にする新規な頭部固定製剤の特徴を明らかにする。私たちは、麻酔によって見落とされている正常な目の 3 つの新しい機能的特性を明らかにしました。1) 覚醒状態でのみ存在するマウスの高周波、低振幅の眼球運動。2) マウスの網膜内の単細胞血流は、 3) マウスの網膜はケタミン/キシラジン麻酔に反応して厚くなる。ここでは、マウスの正常な網膜生理機能を研究するために、麻酔なしで網膜生理機能の研究を可能にする覚醒行動準備の重要な利点を示します。

実験用マウスは、その大きさ、入手しやすさ、配列決定された遺伝子カタログ、およびヒトの病気の側面をモデル化できる能力により、生物医学研究に不可欠なモデルです。特に、哺乳類の目の解剖学的構造と機能の研究が可能になりました。哺乳類の目は、大きさと中心窩の顕著な欠如を除けば、多くの点で人間の目に似ています1。マウスで高解像度の網膜イメージングを実現するには、通常、準備を安定させ、眼の動きを抑制するために麻酔が必要であり、これにより細胞レベルの機能評価はほぼ不可能になります2。いくつかのアプローチでは、手を拘束した状態でマウスの網膜イメージングが可能であることが実証されています 3,4 が、このアプローチの有用性は 1 回のスナップショット写真目的であり、機能的測定に不可欠な安定した光軸を提供しません。

全身麻酔を行うと、生体内での準備が安定し、眼球運動が軽減されます。ただし、正常な生理機能も変化する可能性があり、そのため、in vivo 測定、特に中枢神経系 (CNS) 機能の解釈が制限されます 5,6。この目的を達成するために、行動および生理学的神経科学者は、電気生理学および生体内顕微鏡検査のために脳を安定させ、麻酔の必要性を回避するための頭部固定製剤を開発しました。注目すべきことに、研究では、覚醒状態と麻酔状態におけるさまざまな重要な神経生理学的差異が報告されています8,9。視覚研究における麻酔のもう 1 つの影響は、視覚系に時空間コントラストを提供する自然な眼球運動を除去してしまうことです。自然な眼球運動の抑制は、外側膝状核、上丘、および視覚野への神経節細胞出力の時空間動態を根本的に変化させるマウスの研究10。覚醒準備中の運動が視覚野の生理学的反応を実質的に変化させるという報告もある 11 が、そのメカニズムは完全には理解されていません。したがって、目の動きをそのままにしておくことで、マウスの眼球運動の挙動、特に生物学的な目の動きがどのようにして基本的な視覚生理学に影響を与え、促進するのかについての理解がさらに進む可能性がある。

眼球運動を維持し、麻酔の混乱を排除するという利点に加えて、覚醒したマウスのイメージングは、いくつかの追加の側面で網膜イメージングにも役立つ可能性があります。まず、覚醒している動物をイメージングすることで、長時間の麻酔による光学的混濁を防ぐことができます。これは、麻酔をかけたマウスの眼のイメージングにとって大きな課題でした 12。第二に、覚醒したマウスをイメージングする際には体温調節は必要ありませんが、これは恒常性の生理学に影響を与えることがわかっています13。そして最後に、覚醒したマウスは、行動的または自然な光学的条件を混乱させる可能性があるコンタクトレンズや潤滑剤を必要とせずに、まばたきし、涙膜を常にリフレッシュすることで、通常の目の明晰さを維持します14。

ここで我々は、覚醒マウス網膜を麻酔なしで高解像度で研究することの多くの潜在的な利点を認識し、網膜イメージング用の頭部拘束標本の開発と特性評価によって上記の制限の多くを克服します。当社は、マウスの頭を保持して安定した瞳孔を提供するためのオープンソースの完全 3D プリント装置を提供しています。本体は回転シリンダーの上に吊り下げられており、自由な歩行と歩行速度と行動の同時測定が可能です。高解像度の構造的および機能的網膜イメージングを容易にする光軸の安定性を測定します。さらに、最先端の商用マルチモーダル走査型レーザー検眼鏡 (SLO) および光コヒーレンストモグラフィー (OCT) を使用してマウスの目を画像化することにより、その有用性を示します。次に、カスタムの補償光学走査型光検眼鏡 (AOSLO) を使用して、さまざまな網膜細胞構造をミクロンレベルの解像度で視覚化する高解像度イメージングの利点を実証します。覚醒マウスにおける目の安定性と画質は、SLO イメージングと AOSLO イメージングの両方で検証されています。高速ラインスキャン AOSLO 高速ラインスキャン AOSLO イメージング 15,16 を使用して、これまで見落とされていた微動のような眼球運動を発見しました。この初期の研究では、麻酔によって引き起こされる網膜の 3 つの重要な生理学的変化に焦点を当て、いくつかの科学的機会を紹介します。

一般的なアプローチとセットアップを図 1a に示します。マウスの頭蓋骨は、固定されたヘッドプレートを通して安定に保持されました。 Y 字型ヘッドプレートは、麻酔下で頭皮を 1 回外科的に切断した後、マウスの頭蓋骨の中心に前後軸に平行に移植されました (図 1b)。すべてのマウスはこの手順を生き延びました。ヘッドプレーティングマウスは正常な行動を示し、毛並みが整えられ、正常な活動レベルを持つ健康な外観を維持した。ヘッドプレートの移植に関連する炎症やその他の副作用は観察されませんでした。すべてのマウスの体重も手術前後で一貫したままでした。ヘッドプレートを外科的に配置してから 3 日以内に、頭を拘束したマウスは 30 ～ 60 分間続く 5 回のトレーニングセッションで装置に慣れました。 Y 字型のヘッドプレートは、マウスが前後に自由に移動できるように、回転シリンダー上に吊り下げられた固定アームに取り付けられました。頭部固定装置での訓練と順応後、マウスは嫌悪感や後退反応を示さず、通常の毛づくろい行動を維持し（補足ビデオ 1）、さらに苦痛の外見的な兆候のない穏やかなベースライン状態を示しました。ヘッドプレートの手術により、目は正常なまばたき反射とともに開いたままになりました（補足ビデオ1）。

a 覚醒して行動するマウスの網膜イメージングのための頭部拘束の準備。マウスの頭蓋に外科的に埋め込まれた Y 字型ヘッドプレートは頭の動きを制限しますが、イメージング中は回転シリンダー上での歩行が可能です。 b 前後軸と平行なマウス頭蓋の中心上のヘッドプレートの位置を示す概略図。 c 市販の SLO で撮影した頭部拘束マウスの写真。 d 頭部拘束された覚醒マウスの網膜のマルチモーダル cSLO 画像。さまざまな網膜構造が視覚化されています (左 - 右): 反射率と自家蛍光イメージングにより、NIR (上) と青色 (下) の両方のチャネルの下で主要な表層の網膜血管と神経線維束が明らかになります。トランスジェニックCX3CR1マウスにおける、表在血管網（赤色擬似色として表示）のNIR励起インドシアニングリーン血管造影（ICGA）と青色励起蛍光標識免疫細胞（緑色擬似色として表示）との蛍光同時レジストレーション。深部脈絡膜血管網のICGA。 e OCT 立方体と、頭を拘束された覚醒マウスで画像化された代表的な b スキャン断面図。 f AOSLO 画像はマルチモーダル機能を示します。左: 共焦点反射画像により、神経線維束と網膜毛細血管が明らかになります。中央: 小嚢胞と網膜血管の枝の位相コントラスト画像。右: 樹状突起と軸索が強調表示された YFP 標識網膜神経節細胞の蛍光画像。

頭部拘束装置により、補償光学の助けを借りずに、市販のSLOおよびOCTイメージングプラットフォームを使用して、高品質の構造的および機能的な網膜イメージングが可能になりました（図1d、eおよび補足ビデオ3）。市販の SLO + OCT システム (Heidelberg Spectralis、Heidelberg Engineering、ドイツ) を使用すると、すべての主要な蛍光、自己蛍光、および反射イメージングモダリティが可能になりました。反射率を使用すると、NIR チャネルと青色チャネルの両方で、主要な表在網膜血管と神経線維束が明らかになりました。一般的な血管造影造影剤を覚醒マウスでも使用して、488 nm の励起と約 500 nm のロングパス蛍光を使用して、網膜循環の細動脈、細静脈、および毛細血管を鮮明にイメージングするナトリウムフルオレセイン血管造影 (FA) を明らかにすることもできます。ＮＩＲ光を使用したインドシアニングリーン血管造影（ＩＣＧＡ）は、表層網膜循環を明らかにするとともに、脈絡膜循環を視覚化するための良好な浸透性を実証した。 C57BL6/J マウスでは RPE が高密度に色素沈着しているため、脈絡膜の視覚化は特に困難です。トランスジェニック標識された蛍光のイメージングの可能性を示すために、ケモカイン CX3 受容体 1 を含む細胞内で強化された緑色蛍光タンパク質 (EGFP) を有する CX3CR1 マウスを使用して、蛍光ミクログリアのイメージングも行いました。すべての SLO イメージングモダリティ (蛍光および反射率) において、単一の-フレーム画像のコントラストと信号対雑音比 (SNR) は、内蔵の自動登録ソフトウェア (補足ビデオ 2) を使用して、最大 8.8 Hz のフレームレートで登録を実行するのに十分でした。正面レジストレーションにより、体積測定 OCT キューブのリアルタイム B スキャンレジストレーションが可能になり、複数の画像を平均することで SNR が向上しました (ART、自動リアルタイムトラッキング)19。 96 個の B スキャンで 3D OCT 立方体をイメージしました。内蔵のリアルタイム位置合わせと ART を使用して、OCT キューブは、キューブ全体の取得中に視線の移動と目の動きが残っているにもかかわらず、麻酔で達成されたものと同等の網膜層の鮮明な描写を明らかにしました。

覚醒しているマウスの網膜の高解像度イメージングにおける主な課題は、マウスの瞳孔 (約 2 mm) に入るイメージングビームが頭と目の動きに敏感であることです。瞳孔の位置ずれはクリッピングやケラレを引き起こす可能性があり、波面センシングに重大な影響を与え、画像をぼやけ、機能測定のための不安定な光の送出/集光を引き起こします。ほとんどの高解像度アプリケーションでは、開口数 (NA ～ 0.49) が最大化され、それによってイメージング解像度と集光効率が向上するため、完全に拡張された瞳孔が望ましいです。ただし、機器の光学瞳を動物の瞳に合わせるための安定性の要件も発生します。網膜イメージングの光軸の安定性を定量化するために、5 匹の覚醒マウスの目の射出瞳を SLO で 20 分間以上イメージングしました。カスタムビルドのソフトウェアを使用して瞳孔を追跡し、SLO画像からセグメント化しました（図2aおよび補足ビデオ3）。マウスの瞳孔を追跡して、シミュレートされた直径2.0および1.6 mmのイメージングビームに基づいてビームの空間クリッピングを定量化しました（図2b、c）。 2.0 mm ビームでは、4 匹のマウスが優れた瞳孔安定性を示し、時間の経過とともに瞳孔の平均面積が 1% 未満でクリップされました。 1 匹の動物はより多くのビームクリッピングを示しました (6.65%)。私たちは、これが最適ではないヘッドプレート手術による異常値であることを発見しました。これは、軽度のまぶたの垂れのために不完全な目の開きを残したままでした。より小さい 1.6 mm イメージングビームを使用すると、すべてのマウスで無視できるほどのビームクリッピングが示され、瞳孔面積の 0.112 ± 0.18% に相当しました (平均 ± SD、n = 5 マウス)。ビームクリッピングの時間的影響 (ビームが 10% 以上クリップされた時間の割合) を評価するために、8.8 フレーム/秒 (fps) でキャプチャされた SLO ビデオを評価しました。 2.0 mm ビームでは 94.75 ± 11.13% のフレームがクリップされておらず (平均 ± SD、N = 5 マウス)、1.6 mm ビームを使用した場合には 99.78 ± 0.30% のフレームがクリップされていないことがわかりました。空間的または時間的分析のいずれかにおける瞳孔クリッピングのごく一部は、主に、ヘッドプレート準備の安定性の欠如ではなく、マウスの注視行動に起因すると考えられました。瞳孔の安定性もまた、瞳孔の位置を同時に記録された歩行速度と比較することによって調べられた。ビームクリッピングまたは瞳孔の中心と移動行動との間には相関関係はありませんでした。これは、瞳孔の安定性が安定して固定されたヘッドプレートに起因することを示唆しています（図2d）。空間解析と時間解析の両方から、最大 0.8 m/s (拘束されていないマウスの最高速度の約 1/4) の移動下でも瞳孔が安定していることが示唆されています。したがって、覚醒マウスの目の準備は、より自然な状態での機能的な視生理学を促進する連続的な網膜イメージングに有利に役立ちます。

市販の SLO でキャプチャされたマウスの瞳孔の画像。黄色の実線の円は、追跡された目の瞳孔境界を示します。シアンの実線と破線の円は、それぞれ、高解像度イメージングシステムのシミュレートされた直径 2 mm と 1.6 mm のイメージングビーコンを示します。 b 瞳孔持続性のマッピングは、直径 2 mm (実線) および 1.6 mm (破線) のシステム瞳孔を使用した場合、20 分間にわたって安定した瞳孔を明らかにします。 c 左の Y 軸は、エリア内の瞳孔クリッピングを示し、右の Y 軸は、20 分間のイメージングセッション (N = 8956 フレーム) にわたるクリッピングされていない (<10% エリア) フレームの割合を示します。 d マウスの目の動きと歩行速度を相関させる場合、明らかな相関関係は観察されませんでした。これは、マウスの歩行状態に関係なく、一貫した光学的安定性を示します。

瞳孔の動きに加えて、視線の移動や瞬きなどの眼球運動により、安定したイメージングアプローチが中断される可能性があります。そこで、我々は、覚醒している5匹のマウスの網膜をSLOで20分間イメージングすることにより、視線の移動と瞬きを定量化した。ヒトと比較すると、マウスの瞬き行動の頻度ははるかに低かった（1.78 ± 0.8 瞬き/分、n = 5 マウス）。ヒトの瞬き行動（約 20 回/分）に比べて 20。測定されたマウスの目の瞬きの継続時間は <340.9 ミリ秒で、これは SLO システムの約 3 フレームに相当します。マウスのまれな瞬きイベントは、人間の網膜イメージングで可能である以上の中断のないイメージングを促進します。視線の移動は、55° FOV (8.8 fps) にわたって網膜の特徴を追跡することによって定量化されました。マウスは、頻度は少ないものの、方向を定めた眼球運動により、実験装置の視覚的シーンを自由に観察した。頭部に固定された装置により視線が目の動きのみに制限されるため、これは頭部の向きに影響されずに測定されました。網膜注視シフトの大部分は、自由観察条件で観察されたピークツーピーク範囲±18.00° FOV にわたる水平軸内にありました。これは、垂直方向の追跡された動きの±3.44°と比較して大きかった（図3aおよび補足ビデオ3）。以前の研究21と同様に、主な視線の移動は5°を超え、急速（〜50°/秒）で、まれ（ヒトでは1秒あたり複数のサッカードと比較して、マウスでは1分あたり〜7回）であることがわかりました。マウスには中心窩がないため、これらの視線の移動は画像を中心窩 22 の中心に戻す真のサッカードではなく、代わりに光受容体が密集した領域または光軸近くに存在する小さな神経節細胞の受容野への視覚シーンの再分布を表している可能性があります。目23． 20分間のマウス網膜の半連続ビデオ追跡では、視線行動は、いくつかの好ましい視線方向にわたって持続するクラスター化したパターンを示し、これは目の自然な静止位置、または実験室内の視覚的特徴に基づく好ましい視線方向を示唆している。視線位置の持続性を判断するために、データが分割され、10 秒ごとの局所平均位置に正規化されました。この分析を使用して、網膜位置が 10 秒ウィンドウ内の時間の 80.02 ± 0.065% で視角の 5° 以内に留まることがわかりました。これは、高解像度 AOSLO イメージングの典型的なビデオ取得ウィンドウに対応します。 AOSLOイメージングの範囲が通常5°であるため、これは高解像度イメージングに関連しており、オフライン画像レジストレーションは、共通の特徴に基づいて画像レジストレーションを行う「フレームアウト」エラーを発生させることなく、ストリップまたはフレームレジストレーションアプローチによって動きを修正できる可能性があることを示唆しています。相互相関は困難なアプローチにアプローチします24。

a マウスの視線位置は、網膜オフセットを追跡することによって測定されます。右: 頭部を拘束されたマウスの 20 分間追跡された視線位置を網膜の代表的なフレームに重ね合わせたもの。左: 20 分間の動作追跡は、水平 (上) および垂直 (中央) 方向の視線の移動を示しています。ホイールのロータリーエンコーダーで歩行速度を同時に記録（下）。 b 20 分間にわたって 10 秒のスライディングウィンドウごとに正規化された 5 匹のマウスすべての視線位置。水平軸と垂直軸に重ねられた視線位置分布のヒストグラムは、10 秒のイメージングウィンドウ内で 5° 未満の網膜オフセット (破線のボックスでラベル付け) が存在する可能性が高いことを示しています。 c マウスの視線速度と歩行速度の相関。下のパネルは、視覚化のために上部の灰色のボックスとしてラベル付けされた完成したデータセットを拡大表示しています。

移動と注視行動の間の潜在的な相関関係を調査するために、ロータリーエンコーダーを使用して移動データも同時に記録されました。歩行速度と目の動きには、弱い負の相関関係がありますが、マウス #4 は例外で、弱い正の相関関係がありました。 (R = 0.0226; 0.0030; 0.1294; 0.0060; 0.0135、それぞれ)。動物が静止しているときも動いているときも、視線行動の明らかな変化は観察されませんでした（図3c）。これは、マウスの運動に依存しない安定した画像記録だけでなく、歩行に対応する眼球運動の増強または抑制の欠如も示唆しています。

覚醒しているマウスの目では、まばたきが少ないことと光軸と瞳孔の開口が安定しているため、閉ループ補償光学を使用して波面センシングと波面補正を実行することが可能になりました。拡張したマウスの目の2.0 mmの入射瞳を使用すると、ハートマン・シャック（HS）波面感知スポットが明るいままで、散乱が最小限に抑えられ、75分間以上補正できることがわかりました（図4a〜d）。この調製物は、最適な麻酔下での調製物と同等であった 14,25。安定した HS スポットと瞳孔位置により、瞳孔クリッピングを無視したアクティブ補償光学補正が可能になりました。可変ミラーに印加された波面補正電圧は可変ミラーのダイナミックレンジ内にあり、十分なストロークを示しています。閉ループAO補正を使用すると、網膜画像のコントラストと信号対雑音比（SNR）は、時間の経過による画質の顕著な劣化なしに、1時間以上続く記録にわたって比較的安定したままでした（図4e）。

a、b 麻酔をかけたマウス (a) と覚醒したマウス (b) の 75 分間にわたる AO 補正イメージング。上: HSWS でキャプチャされた瞳孔波面スポットグラム。中央: オレンジ色の長方形でラベル付けされた領域の平均スポット強度プロファイル)。下: AOSLO の画像。平均スポットパターンの強度は、覚醒時データと麻酔時データの 0 時点のピーク強度に対してそれぞれ正規化されました。 c、d 0分と75分の平均スポット（a、bの破線でラベル付け）の強度プロファイルを比較します。すべての強度プロファイルはそれぞれ、ピーク値に対して正規化されました。麻酔をかけたマウスでは、スポットは 75 分でわずかに広がりましたが、覚醒しているマウスは比較的安定していました。 e 経時的な平均ピーク強度のプロット。覚醒しているマウスは、最適な準備を行った麻酔をかけたマウスと同様に、比較的安定した平均ピーク強度を示しました。

AO補正後の高解像度AOSLOイメージングにより、覚醒マウスの細胞網膜構造が明らかになり、麻酔なしで以前の研究で可能であったものを反映しています（図1f）。 796 nm NIR 共焦点イメージングを使用すると、単一の神経線維束や 5 μm 未満の毛細血管などの構造が可視化されました14。 NIR 位相コントラストイメージングを使用して、単一の血球 16 や血管壁 16 などの半透明の構造を視覚化しました。これにより、ラベルフリーの血流測定が可能になりました（後述）。蛍光能力を示すために、Thy-1 YFP 標識神経節細胞とその樹状突起 14 を 488 nm の励起下で画像化しました。 3 つのイメージングモダリティすべてからの AOSLO 画像は、以前に麻酔をかけたマウスで撮影したものと同等のコントラストと解像度を示します。すべての NIR 位相コントラスト、共焦点反射率、および蛍光イメージングモダリティは、イメージング光に対する行動的苦痛が観察されることなく、安全なレベルの光パワーを使用して実施されました (NIR の場合は角膜で 200 ～ 500 μW、NIR の場合は角膜で 220 ～ 330 μW)。蛍光）。 NIR 波長はマウスには見えないと予想されていますが、明るい可視波長を使用してもマウスのひるみや過剰な瞬き行動は誘発されず、これらの光レベルが明白なストレスや羞明を誘発しないことが示唆されています。好ましい注視方向における目の全体の動きは、一般に網膜の動きの 5° 以内に保たれており、これは画像レジストレーションにおける「フレームアウト」エラーがまれであることを意味します。残りの高周波、低規模の補正が観察され、修正されました (補足ビデオ 5)。

AOSLOイメージングを使用して、覚醒しているマウスの網膜の動きが、視線の移動、ゆっくりとしたドリフト、およびこれまで報告されていない高周波で低振幅の眼球運動によって特徴付けられることを発見しました。ビデオレートデータを視覚的に検査すると、単一フレームが単一フレーム内で高速のぐらつき/シアー (約 40 ミリ秒、後述) と、フィールドを変換する大きな視線の動きを示していることがわかります。補正せずに放置すると、たとえ回折限界光学系で画像化したとしても、そのような目の動きは動きの歪み/ぼやけを与えます(補足ビデオ5)。高速スキャン軸（15 kHz）26に平行なストリップベースのレジストレーションを展開して、覚醒マウスのAOSLOイメージングで観察されたラインごとの動きを測定および補正しました（図5aおよび補足ビデオ6）。ストリップ/ラインベースのレジストレーションアプローチの利点を示すために、生データと剛体フレームレジストレーションアプローチに比べて、細部の特徴のコントラストと鮮明さが大幅に向上した、素早い目の動きの後処理デジタル補正を示します(図5b)。ここで紹介するすべての蛍光画像は、デュアルレジストレーション戦略を必要とせずに、各高解像度イメージングモダリティでストリップレジストレーションを実行するのに十分なコントラストを備えています24。また、各モダリティにおける特定のターゲット特徴の断面プロファイルをプロットしたところ、コントラストとシャープネスの向上が示されました（図5c）。ストリップレジストレーションにより、YFP標識網膜神経節細胞の樹状突起の微細な詳細、血管コントラスト、および網膜表面上の神経線維束のより高いコントラストが明らかになりました（図5c）。さらに、ストリップベースのモーション補正により、モーションコントラストのコントラストと鮮明さが改善され、モーションアーチファクトに非常に敏感な血流の灌流がより正確に明らかになりました 27。

a 頭を拘束された覚醒マウスから画像化されたYFP標識網膜神経節細胞を使用したストリップレジストレーションのデモンストレーション。左から右へ: 歪みが最も少ない手動で選択された参照フレーム、目の動きによって歪んだ生の AOSLO 画像、登録された画像、水平方向と垂直方向の目の動きのトレース。 b レジストレーションなし (上)、フレームレジストレーション (中央)、およびストリップレジストレーション (下) を使用した 4 つのモダリティの平均画像。左から右へ: YFP 標識網膜神経節細胞の蛍光画像。主要な網膜血管（細静脈）の位相コントラスト画像。血管のモーションコントラスト画像。毛細血管と神経線維束の共焦点反射画像。 c (b) で白い破線でラベル付けされた 3 つの位置合わせ戦略の強度プロファイル。比較のために、灰色の帯は主要な画像特徴の幅を示し、矢印は他の小さな特徴を示します。 b、cでは、ストリップレジストレーションにより、4つの画像モダリティすべてにおいて画像コントラストとSNRが向上していることがわかります。

商用 SLO とカスタム AOSLO の両方で、単一フレームにフレーム内のぐらつきとずれを引き起こす、高速だが低振幅の目の動きが観察されました (補足ビデオ 4、5)。このような影響は、動きがカメラのフレームレートを超える場合、スキャンデバイスや「ローリングシャッター」を備えたデバイスでよく見られます。麻酔の導入時に効果が消失したため、この動きはイメージングシステムのアーチファクトではありませんでした (補足ビデオ 5)。血管に直交する方向の眼球運動は、せん断プロファイルの形状を追跡することで定量化できます (図 6)。このアプローチを使用して、私たちの知る限り、覚醒しているマウスでは観察されていない急速な目の動きを定量化しました（図6a、bおよび補足ビデオ8）15、16。眼球運動追跡（図６ｃ）のフーリエ変換により、それぞれ２Ｈｚと９Ｈｚの低周波数に２つの顕著なピークが明らかになった。これらのピークは、覚醒しているマウスの特徴的な呼吸周波数 28 と心臓周波数 29 に対応します。ただし、150 Hz を超える高周波領域にもパワーの帯域が観察されました。眼球運動速度トレースのフーリエ変換（図6d）は、帯域幅（30〜150 Hz）を持つ100 Hz付近の速度帯域を示しています。中心窩のある種では、この周波数帯域は眼球振戦の特徴です 30。ただし、マウスには中心窩がなく、視力が 0.5 c/deg31 であるため、ここでは注目に値します。高周波眼球運動振幅は約 6 µm で、従来の眼科用デバイスの分解能よりはるかに低く、これがこれまで見逃されてきた理由の説明になる可能性があります。

a 主要な網膜血管 (静脈) を横切るラインスキャンイメージングを使用した、低振幅だが高周波数の眼球運動の測定。左: 静脈のデカルト画像。黒い矢印は、ラインスキャンイメージングの配置を示します。右: 静脈のラインスキャン画像と、白い線としてオーバーレイされた動きの軌跡。 b 上: ハイパスフィルター (>30 Hz) を使用して強調表示された高周波の目の震えの痕跡。下: 目の動きの速度のトレース。 c 目の動きの追跡のフーリエ変換 (フィルターなし)。パワーは 200 Hz まで観測されました。 2 つの顕著な低周波数ピークがそれぞれ 2 Hz (120 bpm) と 9 Hz (540 bpm) で観察され、これは呼吸と心拍が寄与している可能性があります。 d 眼球運動速度のフーリエ変換。 30 ～ 200 Hz のパワーの上昇が観察され、目の震えの帯域幅を示しています。

麻酔下では、麻酔耐性、前方混濁の発生、または持続麻酔後の回復の可能性のため、マウスの目を一度に 2 時間以上撮像できることはまれです 32,33,34。したがって、覚醒時の準備により、何時間にもわたる半連続的なイメージングセッションが可能になります。この能力と長期にわたるイメージングの品質を実証するために、同じ覚醒し行動しているマウスを 1 時間の間隔で連続 10 時間イメージングしました (図 7a)。 10 時間のイメージング時間は、概日明暗サイクルの通常の覚醒期間と睡眠期間の両方にまたがりました (最初の 4 時間は動物舎の明るい時間に対応し、残りの 6 時間は暗い時間に対応します)。自然にイメージングフィールドを変更する時折の視線の移動にもかかわらず、各イメージングセッションで一貫性を保つためにマウスの向きを手動で調整することで、3°未満の精度で同じイメージングフィールドに戻ることができました（図7bおよび補足ビデオ7）。そのような応用例の 1 つを示すために、10 時間にわたる時刻の関数として高周波の眼球運動を研究しました。急速な眼球運動の振幅は10時間にわたって一定であり、平均は5.95μmまたは10.50分角でした（図7c）。全時点のパワースペクトルは、運動速度の一貫した周波数帯域幅も示唆しました（図7d、eおよび補足ビデオ9）。

同じ頭を拘束し、覚醒して行動しているマウスにおける 10 時間の縦断 AOSLO イメージング。イメージングは 11 時間継続し、1 ～ 1.5 時間ごとに 10 分間のイメージングセッションが 1 回行われました。各セッションにおける同じ静脈の代表的なデカルト AOSLO 画像が表示されました。 b タイムスタンプで色分けされた境界線を持つデカルト画像のモンタージュは、10 時間にわたる異なるイメージングセッションで同じ静脈をナビゲートして位置特定する機能を示しています。 c 10時間にわたる同じ細静脈のラインスキャンデータから測定された眼球振戦の平均振幅。エラーバーは、すべての時点 (N = 15,000 ライン) にわたる眼球運動振幅の標準偏差を示します。 d 30〜200 Hzの一貫した帯域幅で10時間にわたる同一のパワースペクトルを示す眼球運動速度トレースのFT。 e (d) と同じデータの別の斜視図。重ねられた灰色の線は、すべてのパワースペクトルの平均を示します。

高周波眼球運動は、最初は覚醒状態で、次に約 2 時間の K/X 注射後に 1 匹のマウスで測定されました。麻酔導入後、高周波の眼球運動が急速に除去されることが観察されました（図8a、bおよび補足ビデオ10）。この効果の定量化を図 8 に示します。ただし、高周波運動の目に見える減衰は補足ビデオ 5 でも明らかであり、K/X 注射から数分以内に同じ網膜の位置が示されています。 80 分間の眼球運動は 10 µm 未満であり、視線の位置のずれだけでなく、高周波の震えのような動きも抑制されたことが示唆されました。 K/X 注射の 80 分後、顔のわずかなけいれんとむくみが観察されました。速い眼球運動と視線依存性眼球運動は両方とも、徐々にベースラインのような状態に戻りました（図8c）。

a 眼球運動の測定では、深い麻酔下では眼球運動が消失し、浅い麻酔下では眼球運動が再現されますが、覚醒状態に比べて速度が遅いことが示されています。カラーコードはイメージングの時間経過を示し、緑色は覚醒状態、マゼンタは深い麻酔状態、シアンは浅い麻酔状態を示します。 b 眼球運動速度プロファイルおよび c 各時点でのパワースペクトルは、覚醒状態と比較した場合、浅い麻酔下では相対的に速度が低いだけでなく、周波数帯域幅も低いことを明らかにします。

血流は、頭部拘束マウスで以前に報告された技術を使用して測定されました15。簡単に言うと、血管を横切るラインスキャンイメージングを実行すると、流れる血球は時空画像内に角度を付けた軌道を生成し、血管を横切るビームの入射角でスケールされた時間の経過に伴う位置の変化を示します15。血球の速度は、血球プロファイルの傾きを測定することで定量化できます（図9aおよび図S6）。血流は拍動性であることが判明しましたが（図9b）、麻酔時の変動する心拍数（2匹の覚醒マウスでは481および758 Hz）に対応する異なる周波数と速度であり、麻酔をかけたマウスで測定した心拍数と比較してはるかに高い心拍数に対応しています35（ 271.2 ± 1.2 Hz、3 匹のマウスからの n = 5 個の血管）。単一細静脈の血流は、麻酔後 20 分でベースライン測定値 (1.56 ～ 0.89 μL/分) と比較して 43% 減少しました (図 9c)。独立した測定では、K/X 注射直後に血管直径が急激に狭くなることが示され、一方、血流速度の変化は最初はわずかでしたが、20 分間の K/X 注射後に時間の経過とともに大幅に低下しました。これら 2 つのパラメータは同等の変化を示さなかったので、血流とその調節の全体像を明らかにするには直接測定の重要性が強調されます 36。 K/X 誘導後 80 分で眼球運動 (上記) は徐々に戻りますが、血流量は低いままで (0.66 μL/分)、ベースラインより 58% 低かったです。これらの所見は、眼球運動の回復が網膜血流の回復に先行することを示唆しており、K/X麻酔後の同じマウスでは生理学的機能の回復が異なる速度で起こることを示している。覚醒しているマウスからの流量測定値（3匹のマウスからn = 5血管）も、麻酔をかけたマウスにおける私たちのグループから以前に報告されたデータ（20匹のマウスからn = 123血管、図9d）15、19と比較されました。麻酔下で速度が低下した単一の血管にもかかわらず、全体として、流量と血管直径の関係はほぼ同様であることがわかりました。近似されたモデルの直径-流量曲線 (方法で詳述) は、総血流量の全体的なわずかな違いを示しています。

麻酔状態（上）と覚醒状態（下）のマウス網膜の同じ大きな血管のラインスキャン画像。検出された流れる単一の血球は、その速度を表すカラーコードの線でラベル付けされました。 b (a)に示すデータの血流速度を測定したもの。覚醒時データと麻酔時データの両方で拍動性が観察されました。覚醒しているマウスでは、より高い心拍数と流速が観察されました。 c 1 つの血管の血流を経時的に測定すると、麻酔下で血流が抑制されていることがわかります。 d 覚醒マウス (緑色、n = 5 血管、3 匹のマウス) で測定された単細胞血流を、麻酔をかけたマウスの集団 (紫色、n = 123 血管、20 匹のマウス) と比較します。流量-直径モデル曲線がデータに適合します。

OCTを使用して4匹のマウスの覚醒状態から麻酔状態までの網膜形態を測定しました。すべてのマウスは、右目の上側頭四分円で 30° FOV で画像化されました。麻酔をかけたマウスは２時間にわたって実質的な網膜肥厚を示したが、覚醒状態のマウスはそうではなかったことが観察された（図１０ａ）。総網膜厚（TRT）は、3D OCTキューブからカスタムソフトウェアによって定量化されました（図10b）。各データポイントの測定値は図S8に示されています。注射後 80 ～ 110 分で、麻酔をかけたマウスの網膜の厚さは最大 8.0 ± 4.1 μm (n = 4 マウス) の増加に達し、平均 3.9 ± 2.0% の肥厚となりました (p = 0.034、図 10c)。覚醒している対照マウスの網膜では肥厚が観察されました (p = 0.179、n = 4 マウス)。増粘効果は、測定の最後の時点でも進行し続けました。ＴＲＴ変化の正面マップはまた、そのような肥厚効果が網膜領域および離心率全体にわたって均一であることを示唆した（図１０ｄ、ｅ）。

a 覚醒状態および麻酔状態での縦方向 OCT マウス網膜イメージング。 K/X 麻酔の注射後の時間経過に関連して網膜の肥厚が観察されました。 b OCT キューブから測定された総網膜厚 (TRT)。 KX 麻酔の注射後 60 分後には、実質的な肥厚効果が示されます。 c N = 4（平均±SD）マウスの測定では、KX注射に関連した顕著な肥厚が示されています（両側スチューデントt検定）。 d TRT 変化と網膜上の離心率の 3 つの範囲の評価では、有意差は示されません (黒線プロット、平均 ± SD、N = 4 マウス)。 e TRT 変化の正面マップにも、網膜上の領域や構造に関連する顕著な局所的な違いは示されていません。

頭を拘束したマウスの準備により、安定した光軸が得られ、それを介して覚醒マウスの目の細胞スケールの構造的および機能的測定を標準および高解像度の眼科イメージングモダリティで画像化することができます。この安定した眼球イメージング軸を作成すると、マウスの自由な歩行が可能になり、閉じ込めストレスが軽減され、さらに、麻酔の有無にかかわらず、行動研究やマウスの環境との視覚的相互作用へのゲートウェイが可能になります。これにより、多くの研究が皮質における麻酔の影響を調べているように、マウスにおける網膜研究の新しい領域が可能になり、網膜イメージングに対する麻酔の影響を調査および/または補正できる可能性があります。麻酔の影響の一側面を実証するために、我々は初めて、同じマウスの覚醒状態と麻酔状態の両方での血流測定値を特徴付け、比較した。網膜血流 (RBF) を測定することにより、KX 麻酔によって血流が抑制されることがわかります。これは以前の研究の証拠9,37を裏付けるものですが、マウスの3～45ミクロンよりもはるかに小さい血管内に含まれる正確な血流測定に不可欠なミクロンレベルの分解能が得られます15。この研究は、ダイナミクスやベースライン状態を混乱させたり鈍くしたりする可能性のある麻酔の影響なしで最もよく研究される疾患モデルにおける神経血管結合と微小血管の流れの調節の基礎を理解するために不可欠です。また、OCT で測定すると、KX 麻酔がかなりの網膜肥厚を誘発することもわかりました。私たちの知る限り、そのような進行性の肥厚化は報告されておらず、メカニズムは不明です。推測ではありますが、観察された網膜の厚さと RBF の変化は、KX 麻酔によって調節できる眼圧の変化 38 の影響を受ける可能性があると考えられます 39。 KX 麻酔は、呼吸数と心拍数の抑制、および平均細動脈圧の低下を誘発することもわかっており、これが RBF40 の変化を誘発する可能性があります。このような変化の性質を知るにはさらなる研究が必要であるが、この発見は、麻酔はin vivoでのマウス疾患測定の解釈を歪める可能性があり、特に網膜の従来の解釈を混乱させる可能性があるため、覚醒状態でこのような測定を行うことの重要性を強調している。細胞の損失/生存。

in vivo 網膜イメージング研究では、安定したイメージングプラットフォームを獲得することを目的として眼球運動の除去に努めてきましたが、その結果、目への自然な入力が除去されるという結果が伴うことを考慮する価値があります。ここで、自然な目の動きをそのままにしておくことは、目の動きと視覚系がどのように連携して生物の視覚を提供するかをよりよく理解する機会を提供することを私たちは認識しています41。そのような例の 1 つを示すために、覚醒したマウスの自由注視動作中のアクティブイメージングを示します。人間と同様に、マウスが視覚範囲をスキャンする際には、側頭鼻の選好が存在します21。また、中心窩のある哺乳類に通常見られる固視能力が欠如しているにもかかわらず、マウスは好ましい注視位置を持っていることもわかりました21。高時空間分解能 AOSLO によって可能になるより細かいスケールで、人間の眼球微動 (OMT) と同様の時間周波数を持つ高周波数、低振幅の眼球運動が明らかになります。挑発的ですが、両種の高速眼球運動の振幅は、報告されている最大視力の半分の大きさにほぼ相当します 30。今後の研究では、この眼球運動が、受容野の大きさや視力に応じて変化する哺乳類の視覚の保存された特徴であるかどうかを確認することが興味深いでしょう。私たちの知る限り、これはマウスのこの高周波、低振幅の動きに関する最初の報告です (図 6)。この動的な網膜視覚入力を組み込むと、網膜から皮質までにわたるマウスの視覚受容野の時空間特性評価に顕著な影響を与える可能性があります42、43、44。このような目の動きは、昼夜の概日周期全体にわたって10時間維持されることを示します（図7）。重要なのは、この高周波の眼球運動は麻酔を適用することで除去され、これは高解像度のイメージング (動きによるぼやけの除去) にとって有益であるということです。ただし、この情報もビデオレートまたは静的な視覚刺激への自然な入力として削除されます。さらなる研究により、視覚系の時空間コントラストを向上させるために、この顕微鏡スケールで目的を持った眼球運動を組み込むという哺乳類の視覚の共通の要件が明らかになる可能性があります 30,41。この関心と一致して、いくつかの研究では、歩行の影響により、マウスの歩行に関連する視力と特定の視覚ニューロンの反応利得が明らかに増加することが示されており45、今後は網膜レベルで研究される可能性がある。また、このような低振幅、高周波数の眼球運動の測定は、眼球運動制御を担う神経回路の完全性を定量化しようとする多数のマウスモデルにおいて、神経変性疾患に対する新たな有用なバイオマーカーを提供できる可能性があると考えています46。最後に、神経機能と制御の理解を追求するこのような眼球運動の研究を超えて、眼球運動を考慮して補正することが、網膜の高解像度画像を達成するために不可欠であることは注目に値します。補正せずに放置すると、露光時間が約 5 ms (200 Hz フレームレート) を超える高解像度イメージングモダリティでモーションブラーを引き起こします。フラッシュ撮影ではこのようなぼやけを軽減できるかもしれませんが、これまでのところ、特にマウスの場合、このような撮像速度を達成できるビデオ取得検眼鏡はほとんどありません。これは、たとえ完璧な光学系を介しても、覚醒時の網膜画像が 10 ～ 20 マイクロメートルのスケールでぼやけてしまうことを意味します。したがって、高解像度イメージングでは、覚醒マウスの回折限界電位を達成するために、収差補正と 200 Hz を超える高速イメージング/レジストレーションの両方を達成する必要があります。

麻酔を省略することは、長期間にわたって生体内生理学を研究する際にも大きな利点があります。マウスを使ったこれまでの研究は、主に 30 ～ 120 分に制限されている麻酔下での網膜イメージングに焦点を当ててきました。これは、麻酔不耐症 (動物の生存率の低下) または長期間のイメージング時の一時的な白内障形成が原因です。ここでは、同じ動物を 10 時間以上イメージングできる半連続イメージングプロトコルを実行できることを示します。適切な科学的疑問が正当であれば、完全に連続的な記録が可能です。ただし、動物がケージの中で食事、休息、睡眠のために回復するための休憩をとることが推奨されます。このパラダイムは、生理学的課題を数日ではないにしても数時間のスケールで詳細に調査するための巨大な時間枠を開きます。たとえば、概日変化、薬物療法への反応、免疫細胞の動き 36、全身的な血糖調節、運動療法 47 を、1 回のセッションで数秒から数時間かけて、また、麻酔毒性の蓄積や蓄積することなく数日にわたって半連続的に研究できるようになりました。前方混濁の合併症は、従来、麻酔を必要とするこのような研究を制限していました。

実験用マウスは、人間の病気の側面を再現するために使用される最も人気のあるモデルの 1 つです。ここでは、麻酔の必要性を回避することで、哺乳類の目の正常な生理機能を捉えるためにモデルをさらに一歩近づけます。このアプローチを世界中で利用できるようにするために、3D プリンターにアクセスでき、自由市場の部品にアクセスできるラボであればどこでも再現できる、低コストの 3D 印刷可能なソリューションが提供されます。この設計は、概念実証を提供し、麻酔なしでマウスでの安定した眼の測定を民主化することを目的としています。この研究に基づいて構築できる応用例は無数にあり、視覚、行動、神経構造、機能的完全性、およびマウスの視覚の基本的な生理学の基礎についての理解を進める可能性があります。私たちは、初期の応用例のいくつかで、多くの基本的な生理学的機能に対する麻酔の影響が調査されると期待しています。他の人は、解像度と網膜追跡機能を使用して、自由観察またはシミュレートされた視覚環境での高速かつ顕微鏡的な目の位置の記録を改善する可能性があります。臨床眼科画像処理ではめったに使用されない麻酔の必要性を回避することで、マウスと人間の視覚生理機能の比較がさらに近づいたと我々は主張する。最後に、数時間から数日間続く長期評価の価値により、治療、概日周期、およびより緩やかな変化への反応にとって非常に価値のある、新しい時間枠にわたる生理機能と構造の研究の新しい体制が可能になります。そうしないと、麻酔によって画像化ウィンドウが制限されるという物流上の課題により、これらの画像が見逃されてしまう可能性があります。これらを総合すると、私たちは、これが生物医学研究における最も強力なパートナーの 1 つであるマウスの神経および行動研究における刺激的な新しい研究の始まりを表すものと期待しています。

マウスの頭部は、外科的に移植された Y 字型ヘッドプレートの横に配置されたアームを保持するクランプによって拘束されました。ヘッドプレートは、マウスがイメージング中に自然な姿勢と歩行で自由に歩行できるように、ランニングホイール (直径 90 mm) の上に垂直に配置されました。クランプを横方向に配置することにより、対側の眼の撮像も可能になります。クランプは 3D プリントされた 2 つの連動部品で構成され、ヘッドプレートの周囲にしっかりとフィットし、片側だけで保持されているにもかかわらず、安定したヘッドレストを確保します。ベアリングとアクセルを除くホイールプラットフォームのすべてのコンポーネントは、ポリ乳酸を使用して 3D プリントされました (Ultimaker、Ultimaker BV、ユトレヒト、オランダ)。ロータリーエンコーダ (ENS1J-B28 L00256L、Bourns, Inc、リバーサイド、カリフォルニア州、米国) が車輪の車軸に取り付けられ、車輪が同期して回転できるようになりました。エンコーダー出力は、データ収集ボード (USB-6001、National Instruments、オースティン、テキサス州、米国) によって収集されました。歩行距離と速度は、MATLAB R2019a (The MathWorks, Inc.、マサチューセッツ州、米国) を使用してエンコーダー出力信号から抽出されました。移動データは、同時に取得された画像データのタイムスタンプに基づいてオフラインで同期されました。 3D プリントファイルと詳細な組み立て手順は、「https://github.com/GP-Feng/Awake_Mouse_Imaging_CommBio.git」で公開されています。

すべての動物実験は国立衛生研究所のガイドラインに従って実施され、ロチェスター大学の動物資源に関する大学委員会によって承認されました。 C57BL/6J マウスは、The Jackson Laboratories (バーハーバー、メイン州、米国) から購入しました。実験には生後6〜10か月のマウス12匹を使用した。すべての動物は、ロチェスター大学医療センターのビバリウム実験動物施設で、12 時間と 12 時間の明暗サイクルで、餌と水を自由に与えて飼育されました。

ヘッドプレートの移植と動物の訓練のタイムラインプロトコルを図S1に示します。ブプレノルフィン皮下注射 (0.5 ～ 1 mg/kg) を手術の 24 時間前に投与しました。手術当日、マウスの体重を量り、麻酔をかけ、小動物定位フレーム（900 シリーズモデル、David Kopf Instruments、タジュンガ、カリフォルニア州、米国）に移し、平らな頭蓋骨用に設定されたイヤーバーと切歯バーで固定しました。最初に頭の背面を剃り、次に皮膚を 70% イソプロピルアルコールの準備パッド (カタログ番号: MDS090735、Medline、米国イリノイ州ノースフィールド) で洗浄しました。頭蓋骨の基部から目の間の前頭骨まで、長さ約 2 ～ 3 cm の正中線切開を行いました。次に、側頭筋が頭蓋骨に挿入される場所に横方向の切開を加えました。上にある筋膜を鈍的切開と頻繁な洗浄によって穏やかに除去し、頭蓋骨表面を露出させた。次に、歯科用セメント (Jet XR Shadow Powder、Lang Dental、米国イリノイ州ホイーリング) とシアノアクリレート接着剤 (比率 2:1) (Krazy Glue Maximum Bond) の混合物を塗布して、Y 字型の 3D プリントされたヘッドプレートを頭蓋骨にしっかりと固定しました。、Krazy Glue、米国）。ヘッドプレートは、冠状縫合糸とブレグマの交点の中心に配置され、一方の内側アームが鼻骨に向かう正中線と整列する必要があります。マウスは、術後 3 日間回復するために、段ボールハウスを備えた単一のハウジングに入れられました。全体として、マウスの健康状態は、毛皮の外観と活動レベルを視覚的に観察することによって毎日監視されました。回復後、マウスを頭を拘束されたイメージングプラットフォームに順応させるために、30〜60分のトレーニングセッションを少なくとも5回実施しました。マウスの体重をトレーニングセッションごとにモニタリングしました。最初の 2 つのセッションでは、マウスをケタミン - キシラジン混合物 (100 mg/kg ケタミンおよび 10 mg/kg キシラジン) で浅く麻酔し、慣れさせるためにプラットフォームに頭を拘束して回復させました。回復後、マウスを 30 ～ 45 分間歩行させました。これら 2 つのトレーニングセッションは、連続した麻酔の適用を避けるために 24 時間間隔で実施されました。その後、麻酔なしで 45 分間のトレーニングセッションを 3 回以上実施し、マウスを完全に覚醒した状態のヘッドレスト条件に順応させました。安定した歩き方や姿勢、毛づくろいなどのリラックスした行動特性を示すマウスは、環境に慣れており、イメージングの準備ができていると見なされます。

覚醒行動マウスを用いて画像化する場合、瞳孔拡張以外の追加の処置は目に適用されなかった。覚醒しているマウスまたは麻酔をかけたマウスのいずれかに瞳孔拡張を適用しました。これは、1％トロピカミド（Sandoz、スイス、バーゼル）および2.5％フェニレフリン（Akorn、米国イリノイ州レイクフォレスト）の点眼薬を点眼することによって達成されました。イメージングは、各イメージングセッションの開始前に 10 ～ 15 分間の暗順応フェーズを設けて暗い環境で実行されました。私たちのプラットフォームではマウスによるロール回転軸の調整が制限されていたため、AOSLO イメージングの FOV はほとんどが網膜の上象限にありました。麻酔をかけたマウスで画像化する場合、塩酸ケタミン（投与量100 mg/kg）とキシラジン（投与量10 mg/kg）の混合物を腹腔内注射しました。外部加熱パッドおよび直腸プローブ温度計 (Physiosuite、ケント) を使用して、麻酔をかけたマウスの体温を 37.0 °C に監視および維持しました。麻酔下での脱水によって引き起こされる目の混濁を防ぐために、コンタクトレンズ（Advanced Vision Technologies、米国コロラド州レイクウッド）を撮影対象の眼の上に置き、人工涙液（GenTeal、Alcon Laboratories, Inc、米国テキサス州フォートワース）を装着しました。）は、イメージング中に 20 分ごとに定期的に適用されました。

SLO および OCT イメージングは、市販のマルチモーダル網膜イメージングプラットフォーム (HRA Spectralis、Heidelberg Engineering、ハイデルベルク、ドイツ) を使用して実行されました。 OCT 画像と SLO 画像はどちらも、指定されていない限り 30° FOV 対物レンズで撮影されました。 SLO のピクセル解像度は 1536 × 1536 でしたが、OCT キューブのボクセルは 1536 × 596 × 97 でした。 OCT キューブの正面 FOV は 20° × 20° で、内蔵の自動網膜追跡 (ART) 機能を使用して位置合わせが行われました。 SNR を向上させるために、各 OCT スライスも 40 フレームで平均化されました。

マルチチャネル AOSLO については、以前の文献 14 で説明されています。反射共焦点、位相コントラスト、蛍光イメージングなどのモダリティによる網膜イメージングが可能になります。共焦点反射率および位相コントラストイメージングは、帯域幅 17 nm の 796 nm スーパールミネッセンスレーザーダイオード (角膜で 200 ～ 500 μW、S790-GI-15、Superlum、アイルランド) を使用して実行されましたが、488 nm レーザーダイオード (220 ～ 330角膜でのμW、iChrome MLE、Toptica Photonics、ファーミントン、ニューヨーク州、米国）を蛍光イメージングの励起源として使用しました。 2.1 ADD ピンホールは、共焦点反射率と位相コントラストイメージングのために NIR チャネルのイメージプレーンに使用されました。位相コントラスト画像を提供するために、ピンホールは最大 22 ADD だけ横方向にオフセットされました (Guevara、2020)。ハートマン・シャック波面センサー (HSWS) を適用して、マウスの目の波面をリアルタイムで測定しました。変形可能ミラー (DM97-1、ALPAO、モンボノサンマルタン、フランス) と組み合わせることで、マウスの目に固有の収差が閉ループで補正されました。

まぶたと眼角に焦点を合わせ、NIR SLO を使用して、768 × 768 ピクセルで 8.8 fps の速度でマウスの目の射出瞳を撮像しました。イメージングは、覚醒状態にある 5 匹の健康なヘッドプレートマウスで行われました。各イメージングセッションは約 20 分間続き、システムが許可する最大長 (59.88 秒) で 17 個のビデオが記録されました。ギャップは 2 回の取得間のデータバッファリング時間に応じて 5 ～ 30 秒の範囲で変化します。 Matlab で書かれたカスタム構築の瞳孔追跡アルゴリズムを使用して、SLO ビデオから瞳孔領域を自動的に追跡しました。テクスチャベースのセグメンテーション戦略が使用されました (図 S2)。まず、標準偏差 (STD) フィルターを画像に適用して瞳孔領域を強調しましたが、瞳孔はまぶたや毛皮などの周囲の組織に比べて空間分散が小さくなっています。次に、空間 STD マップをしきい値処理 (STD <0.25) で 2 値化し、分水嶺アルゴリズムで瞳孔領域をセグメント化しました。瞳孔領域の輪郭は最終的に楕円関数で適合されました。論理ゲートは、検出された瞳孔サイズと位置の異常に大きくて急速な変化による偽陽性を除去するように設定されました。瞳孔マッチング性能は、マウスの目のセグメント化された射出瞳と、すべてのデータ点の平均位置に位置する静的な仮想円形入射瞳との間の重複領域として定量化されました。マウスの移動との相関を分析する場合、瞳孔一致データは 1 秒の時間ビン全体で平均され、同時に記録された移動データを調整しました。

まばたきと視線移動の測定の実験プロトコルは瞳孔測定と同じでしたが、唯一の違いは、SLO が網膜の神経線維層に焦点を合わせていたことです。ここでは、フレームの平均画像強度に基づいて瞬きイベントが検出されました。フレームの画像強度がビデオ全体の平均画像強度の 60% を下回る場合、フレームには点滅イベントが発生するとみなされました (図 S3)。 SLO 網膜画像のグローバルオフセットを定量化するために、Matlab で書かれた半自動網膜追跡アルゴリズムを実装しました。視神経乳頭や血管接合部など、明確に定義された特徴を持つ 3 つの異なる参照テンプレートが、最初に参照画像から手動で選択されました (図 S4a)。テンプレートのサイズと位置は、経験豊富なユーザーがガイド付きユーザーインターフェイスを通じて決定しました。 3 つのテンプレートは、各網膜画像フレームとの 2D 相互相関を実行するための参照として使用されました (図 S4b)。網膜オフセットは、2D相互相関から抽出された3つの相対オフセットのうちの1つによって決定され、最大の正規化相関係数（NCC）を持ちます（図S4c）。まばたきが発生したときに日付ポイントを削除するためにロジットゲートが実装されました。

以前に報告されたカスタムストリップベースの位置合わせアルゴリズムは、AOSLO 画像の動きの歪みを補正するために使用されました 26。簡単に説明すると、画像は低速走査軸に沿ってストリップに分割され、各ストリップは 2D 相互相関を使用して個別に参照画像に登録され、速い目の動きによって引き起こされるシアー効果を補正しました。ここで、選択されたストリップの幅は 32 ライン (サンプリングレート 468 Hz に相当) で、これは高周波の目の動きの上部帯域幅 (約 200 Hz) のナイキストレートをわずかに超えています。 NCC が 0.5 より小さい登録ストリップは「登録失敗」とみなされ、登録画像から削除されました。蛍光画像を登録するために、弱い光子数に対する 2D 相互相関パフォーマンスを向上させるために、登録前にすべての画像が \(\sigma =5\) ピクセルの 2D ガウスカーネルで畳み込まれていました。

高周波、低振幅の眼球運動は、主要な網膜血管を横切る 1D イメージングビームを 15 kHz で走査することにより、AOSLO で測定されました。目の動きが存在すると、撮像された血管の時空間プロファイルが剪断されます（図S5a右）。血管に直交する眼球運動成分の振幅 \(\left|{{{{{{\boldsymbol{w}}}}}}}_{{{{{{\boldsymbol{1}}}}} }}\right|\) は次のように抽出できます: \(\left|{{{{{{\boldsymbol{w}}}}}}}_{{{{{{\boldsymbol{1}}}}} }}\right|=\left|{{{{{\bf{v}}}}}}\right|{{\sin }}(\theta )\)、\(\theta\) は角度です血管と走査軸の間の距離、\(\left|{{{{{\bf{v}}}}}}\right|\) は時空血管プロファイルのせん断です (図 S5a 左) ）。動き補正のためのストリップ位置合わせアルゴリズムと同様に、完全に自動化されたアルゴリズムがシアートレースの抽出に使用されましたが、空間方向に沿った 1D 相互相関のみが実行されます。 32本の走査線の幅を持つ20個の参照ストリップが、最初に時空間画像からランダムに選択されました（図S5b）。各基準ストリップを使用して空間軸に沿って 1D 相互相関を実行して 20 個の候補トレースを生成し、平均値に正規化して位置合わせしました。候補トレース内のオフセットデータポイントは、前の時点と比較して 10 ピクセルを超える変化があり、偽陽性として扱われ、今後の分析から除外されました。最後に、中央値を計算することにより、20 個の候補トレースが最終出力モーショントレースとしてポイントごとにマージされました (図 S5c)。抽出された運動追跡は、登録された時空画像を調査することにより、経験豊富なユーザーによって実行される視覚検査によって検証され（図S5d）、登録が不十分な画像による測定は「失敗」とみなされ、分析から削除されました。

我々の以前の出版物で詳しく説明されているアプローチを使用して、覚醒マウスの単細胞血流を非侵襲的に測定しました15。簡単に言うと、低速（ガルバノ）スキャナーをフリーズすることによって血管を1D（15 kHz）で斜めにスキャンし、連続したスキャンを時間をかけて連結して、時空画像を形成しました（図S6a）。血球は斜めの縞として表示され、スキャン全体の位置を示します。流れの方向と 1D スキャンの位置の間の角度 (その後取得された 2D ラスター画像から抽出) と組み合わせた縞の傾きを、ラドン変換を使用する自動アルゴリズムで使用して、血球速度を抽出しました。私たちの時空画像では、垂直方向に近づいている縞は、より高速な細胞を表しています。ラドンアルゴリズムは、時空画像を重複する ROI に分割することによって動作します。各 ROI は反復的に 180 度回転され、反復ごとに 1D 強度投影が抽出されます。標準偏差は各 1D 投影に対して計算され、最高値は主角度を示し、ROI の速度が得られます。この技術の測定帯域幅は 0.03 ～ 1275 mm/s で、覚醒しているマウスの網膜における生物学的に可能な血球速度を測定するには十分以上でした。拍動流は高い時空間分解能で測定され、時空画像上に速度カラーマップとして重ねられました（図S6b）。血管内腔の直径を決定するために、血管のモーションコントラスト画像が 2D デカルト画像から生成されました。サイズが 50 μm 未満の微小血管内の RBC カラムを通る前方散乱光と多重散乱光のイメージングは、内腔直径の正確な測定に役立ちました。速度と直径の測定値を組み合わせると、各容器を通過する平均流量 (μL/分) が得られます。これらの測定は、上のセクションで説明した目の動きの測定と同時に行われました。流量-直径モデル曲線を、2 つの母集団と比較して測定データに適合させました。簡単に言えば、使用されたモデルは y = axb の形式でした。ここで、y は流量 (μL/min)、x は直径 (μm) です。

網膜厚測定はHRA OCTで行いました。「フォローアップ」モードを使用して、最初の時点を基準として網膜の同じ位置で縦断イメージングを実行しました。総網膜厚（TRT）は、硝子体-内境界膜（硝子体-ILM）境界と外節-網膜色素上皮（OS-RPE）境界間の距離として定義されました（図S7a、b）。視神経乳頭を中心とする視覚度8°の円形領域は、セグメンテーションが困難であり、分析ではマスクされました（図S7c）。層は、参考文献によって以前に報告された戦略に基づいたカスタムのグラフ理論動的計画法セグメンテーションアルゴリズムによって検出されました。 48.

現在の研究のすべてのデータは、Jackson Labs (メイン州バーハーバー) ストック (CX3Cr1、thy-1 YFP、B6 ストック) からの C57BL/6 J バックグラウンドの 12 匹のマウスから得られました。マウスは、ジャクソン研究所から直接のものとして、または元の創始者マウスからの数世代のコロニー子孫として画像化されました。研究におけるすべての測定は、同じマウスで複数回（たとえば、図2〜4、6〜9）、または比較のために複数のマウスで実行されました。 2 つの異なる時間またはグループ間で比較する場合、条件を比較するための単純な対応のある t 検定に基づいて差異が評価されました。統計検定は Matlab® で実行され、p 値 *p < 0.1、**p < 0.05 を満たす有意性の閾値で報告されました。実際の p 値が報告されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

図の背後にあるソースデータは、補足データ 1 ～ 7 ファイルに含まれています。処理された SLO データと生の AOSLO および OCT ビデオは、パブリックリポジトリ (Zenodo): https://doi.org/10.5281/zenodo.7806898 で入手できます。追加のデータは、合理的な要求に応じて著者から入手できます。

頭部拘束マウスのセットアップの 3D プリントファイルとデータ処理用のすべてのコードは、パブリックリポジトリ (GitHub): https://github.com/GP-Feng/Awake_Mouse_Imaging_CommBio で入手できます。

Remtulla, S. & Hallett, PE マウスの模式的な目とラットとの比較。ヴィス。解像度 25、21–31 (1985)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Nair、G. et al. 一般的な麻酔薬が眼球運動および網膜電図に及ぼす影響。博士。眼科。上級眼科。 122、163–176 (2011)。

記事 Google Scholar

Hawes, NL、Smith, RS、Chang, B.、Davisson, M. & Heckenlively, JR マウス眼底写真と血管造影: 正常および変異表現型のカタログ。モル。ヴィス。 5、22 (1999)。

パケス、M.ら。マウスの共焦点走査レーザー検眼鏡による高解像度眼底イメージング。ヴィス。解像度 46、1336–1345 (2006)。

論文 PubMed Google Scholar

Vinck, M.、Batista-Brito, R.、Knoblich, U. & Cardin, JA 覚醒と運動は、皮質活動パターンと視覚的符号化に明確に寄与します。ニューロン 86、740–754 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chockanathan, U. et al. 実行中のペアワイズ相関の変化は、主嗅球におけるグローバルネットワークの状態を再形成します。 J. Neurophysiol. 125、1612–1623 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Dombeck, DA、Khabbaz, AN、Collman, F.、Adelman, TL & Tank, DW 覚醒している移動マウスにおける細胞分解能による大規模な神経活動のイメージング。ニューロン 56、43–57 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スレーン、AS et al. 全身麻酔は、覚醒しているマウス皮質におけるアストロサイトのカルシウムシグナル伝達を選択的に破壊します。手順国立アカデミー。科学。 USA 109、18974–18979 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rakymzhan、A.、Li、Y.、Tang、P.、および Wang、RK 定量的光コヒーレンストモグラフィー血管造影法によって明らかにされた、覚醒マウス皮質と麻酔マウス皮質における脳血管構造と血流の違い。 J. Neurosci. 方法 353、109094 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cang, J.、Kalatsky, VA、Löwel, S. & Stryker, MP マウスの皮質可塑性の尺度としての固有信号の光学イメージング。ヴィス。神経科学。 22、685–691 (2005)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

金子 M.、Fu、Y. & Stryker、MP 運動は、成人の視覚野における刺激特異的反応の増強を誘発します。 J. Neurosci. 37、3532–3543 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Calderone, L.、Grimes, P. & Shalev, M. ラットおよびマウスにおけるキシラジンおよびケタミン-キシラジン麻酔によって誘発される急性可逆性白内障。経験値目の検査 42、331–337 (1986)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Xiong、J.ら。イソフルランは、血管収縮および震えの閾値を顕著かつ非線形に減少させます。麻酔学 85、240–245 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Geng、Y.ら。生きたマウスの眼における補償光学網膜イメージング。バイオメッド。オプション。急行3号、715号（2012年）。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Joseph, A.、Guevara-Torres, A.、および Schallek, J. 生体網膜の最小血管から最大血管までの単細胞血流の画像化。 eLife 8、e45077 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guevara-Torres, A.、Joseph, A. & Schallek, JB 生きたマウスの眼における網膜血球流束、速度、ヘマトクリットおよび毛細血管幅のラベルフリー測定。バイオメッド。オプション。 Express 7、4228 ～ 4249 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Warner, EJ & Padmanabhan, K. C57BL/6J マウスにおける頭部固定自発的走行行動の性差。ユーロ。 J. Neurosci. 51、721–730 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

Paster, EV、Villines, KA & Hickman, DL マウス腹部腫瘍モデルのエンドポイント: 現在の基準の改良。コンプ。医学。 59、234–241 (2009)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barteselli、G. et al. モデルの眼における近赤外線画像と断層撮影スキャン間の位置合わせにおけるハイデルベルクスペクトルの精度: 多施設研究。午前。Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． 156、588–592 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

王、MTM 他。まばたきが眼の表面と涙液層のパラメータに与える影響。オクル。サーフィン。 16、424–429 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Saketani, T. & Isa, T. C57BL/6 マウスにおける自発的なサッカード様の急速な眼球運動の定量的分析。神経科学。解像度 58、324–331 (2007)。

論文 PubMed Google Scholar

アラバマ州ヤーバス著「目の動きと視覚」(Plenum Press、1967)。

Jeon, CJ、Strettoi, E. & Masland, RH マウス網膜の主要な細胞集団。 J. Neurosci. 18、8936–8946 (1998)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dubra, A. & Harvey, Z. 高速スキャン眼科機器からの 2D 画像の登録。参照：Biomedical Image Registration、WBIR 2010、Vol 6204 (Fischer, B.、Dawant, BM、Lorenz, C. 編)。コンピューターサイエンスの講義ノート (Springer、ベルリン、ハイデルベルク、2010 年)。

Schallek, J.、Geng, Y.、Nguyen, H. & Williams, DR in vivo 適応光学イメージングと ex vivo 特性評価を使用した、生きたマウス網膜における網膜周皮細胞の形態とトポグラフィー。調査します。オプタルモール。ヴィス。科学。 54、8237 (2013)。

記事 Google Scholar

ヤン、Q.ら。補償光学走査型光検眼鏡における閉ループ光学安定化とデジタル画像レジストレーション。バイオメッド。オプション。エクスプレス 5、3174 ～ 3191 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Bedggood, P. & Metha, A. 毛細管流中の人間の血液成分によって生成されるコントラストおよび運動信号の分析。オプション。レット。 39、610–613 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

Irvin、CG & Bates、JHT マウスの肺機能の測定: サイズの課題。呼吸してください。解像度 4、4 (2003)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Butz, GM & Davisson, RL 覚醒マウスの心血管パラメータの長期遠隔測定: 生理学的ゲノミクスツール。生理。ゲノミクス 5、89–97 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ko、H.-K.、Snodderly、DM、Poletti、M. サッケード間の眼球運動: 眼球のドリフトと振戦の測定。ヴィス。解像度 122、93–104 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

Prusky, GT, West, PWR & Douglas, RM マウスとラットの視力の行動評価。ヴィス。解像度 40、2201–2209 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang、P.ら。生体内細胞解像度の神経および血管網膜イメージングのための光コヒーレンス断層撮影ボリュームの時間的スペックル平均化。ニューロフォトニクス 6、041105 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, X.、Bedggood, P. & Metha, A. げっ歯類の眼における補償光学の画質の限界。バイオメッド。オプション。エクスプレス 3、1811 ～ 1824 年 (2012)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Guevara-Torres, A.、Williams, DR & Schallek, JB 造影剤を使用せずに生きているマウス網膜の半透明の細胞体をイメージングします。バイオメッド。オプション。エクスプレス 6 号、2106 ～ 2119 年 (2015 年)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiao-Ping、Y. 他意識のある麻酔をかけたマウスの心機能の心エコー検査による評価。午前。Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．ハートサークル生理。 277、1967 年～1974 年 (1999)。

Joseph, A.、Chu, CJ、Feng, G.、Dholakia, K. & Schallek, J. 補償光学を使用した生体網膜における免疫細胞動態のラベルフリーイメージング。 eLife 9、e60547 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Choi, W. et al. 超高速スペクトル/フーリエドメイン OCT によるヒトおよびラットの網膜の拍動総血流の測定。バイオメッド。オプション。エクスプレス 3、1047 ～ 1061 (2012)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhi, Z.、Cepurna, WO、Johnson, EC、Morrison, JC & Wang, RK ラットの網膜、脈絡膜、視神経乳頭の血流変化に対する眼圧の影響を光学的微細血管造影法で調査。バイオメッド。オプション。エクスプレス 3、2220 ～ 2233 (2012)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Qiu, Y.、Yang, H. & Lei, B. マウスの眼圧に対する一般的に使用される 3 種類の麻酔薬の影響。カー。目の検査 39、365–369 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Erhardt, W.、Hebestedt, A.、Aschenbrenner, G.、Pichotka, B. & Blümel, G. マウスにおけるさまざまな麻酔薬 (ペントバルビトン、ケタミン-キシラジン、カルフェンタニル-エトミデート) との比較研究。解像度経験値医学。 184、159–169 (1984)。

記事 CAS Google Scholar

Intoy, J. & Rucci, M. 細かく調整された目の動きにより、視力が向上します。ナット。共通。 11, 795 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Niell, CM & Stryker, MP マウスの視覚野における高度に選択的な受容野。 J. Neurosci. 28、7520–7536 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ahn, J.、Rueckauer, B.、Yoo, Y. & Goo, YS スパイク誘発共分散によるマウス網膜の受容野の新しい特徴。経験値ニューロビオール。 29、38–49 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Tring, E.、Duan, KK および Ringach, DL の ON/OFF ドメインは、マウス視覚野の受容野構造を形成します。ナット。共通。 13、2466 (2022)。

Mineault, PJ、Tring, E.、Trachtenberg, JT & Ringach, DL 移動中の空間分解能が向上し、マウスの一次視覚野における注意力が高まりました。 J. Neurosci. 36、6382–6392 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Levy, DL、Sereno, AB、Gooding, DC & O'Driscoll, GA 統合失調症における視線追跡機能障害：特徴付けと病態生理学。カー。上。振る舞い。神経科学。 4、311–347 (2010)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

チウ、C.-J. & Taylor, A. 食事性高血糖、血糖指数、および代謝性網膜疾患。プログレ。レチン。目の検査 30、18–53 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Srinivasan, PP、Heflin, SJ、Izatt, JA、Arshavsky, VY & Farsiu, S. 病理学による欠落層の有無にかかわらず、マウス網膜の SD-OCT 画像における最大 10 層境界の自動セグメンテーション。バイオメッド。オプション。 Express 5、348–365 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

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Schallek 研究室は、R01 EY028293 および P30 EY001319 に基づき、国立衛生研究所の国立眼科研究所によって支援されています。パドマナバンは、国立衛生研究所 R01 MH113924、P50 HD103536、および国立科学財団 (NSF) CAREER 1749772 からの助成金によって支援されています。この研究は、ロチェスター大学眼科への無制限助成金、キャリア開発賞、ニューヨーク州ニューヨークの失明予防研究 (RPB) からキャリアアドバンス賞およびスタイン賞を受賞。 Dana Foundation David Mahoney Neuroimaging Award、および Genentech Inc. (Schallek) からの研究助成金を受賞しています。

ロチェスター大学生物医工学部、ロチェスター、ニューヨーク州、14620、米国

フォン・グアンピン＆コーシャ・ドラキア

ロチェスター大学視覚科学センター、ロチェスター、ニューヨーク州、14627、米国

グアンピン・フェン、アビー・ジョセフ、コーシャ・ドラキア、フェイ・シャン、チャールズ・W・ファイファー、デレク・パワー、クリシュナン・パドマナバン、ジェシー・シャレック

ロチェスター大学光学研究所、ロチェスター、ニューヨーク州、14620、米国

それでジョセフは

ロチェスター大学神経科学学部、ロチェスター、ニューヨーク州、14642、米国

フェイ・シャン、クリシュナン・パドマナバン、ジェシー・シャレック

Flaum Eye Institute、ロチェスター大学、ロチェスター、ニューヨーク州、14642、米国

チャールズ・W・ファイファー & ジェシー・シャレック

ロチェスター大学知的発達障害研究センター、ロチェスター、ニューヨーク州、14642、米国

クリシュナン・パドマナバン

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JS がこの研究を発案しました。 KP は、頭部拘束マウスの準備とセットアップのアイデアと設計を提供しました。 GF、AJ、KD、FS、CWP、DP、および JS が実験を設計し、実行しました。 GF、AJ、および FS がデータを分析および解釈しました。 GF、AJ、KD、FS、DP、JS が原稿を書きました。著者全員が原稿を校正および編集しました。

ジェシー・シャレックへの通信。

この研究室は、Genentech Inc. からの共同研究助成金によって一部支援されました。Jesse Schallek は、ロチェスター大学を通じて眼科用画像技術に関する米国特許を取得しています。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Thomas J. Gast ともう一人の匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Joao Valente。査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Feng、G.、Joseph、A.、Dholakia、K. 他。覚醒行動マウスにおける高解像度の構造的および機能的網膜イメージング。 Commun Biol 6、572 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04896-x

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受信日: 2022 年 5 月 18 日

受理日: 2023 年 5 月 2 日

公開日: 2023 年 5 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04896-x

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