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Scientific Reports volume 13、記事番号: 9226 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

血液網膜関門の完全性の破壊は、血管新生性加齢黄斑変性症 (nAMD) や糖尿病性黄斑浮腫 (DME) など、多くの眼疾患の病理学的変化の基礎となります。 抗血管内皮増殖因子（VEGF）療法は疾患治療に革命をもたらしましたが、患者の満たされていないニーズを満たすには依然として新しい治療法が必要です。 新しい治療法の開発を支援するには、動物モデルの眼組織の血管透過性の変化を測定する堅牢な方法が必要です。 ここでは、マウスの目のさまざまなコンパートメントにおける蛍光色素の蓄積をリアルタイムで測定できる、蛍光測光法を使用して血管透過性を検出する方法を紹介します。 我々は、ぶどう膜炎、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生（CNV）のモデルなど、さまざまな血管漏出の増加を伴ういくつかのマウスモデルにこの方法を適用しました。 さらに、CNVのJR5558マウスモデルにおいて、同じ動物の眼において、抗VEGF後処理により透過性の縦方向の減少が観察された。 我々は、蛍光測光法はマウスの眼の血管透過性を測定するための有用な方法であり、動物を犠牲にすることなく複数の時点にわたって使用できると結論付けています。 この方法は、病気の進行やその根底にある要因を研究するための基礎研究だけでなく、創薬や新規治療法の開発にも使用できる可能性があります。

浮腫とその後の組織損傷を引き起こす血液関門の完全性の喪失は、敗血症 1、癌 2、脳卒中 3 を含むさまざまな疾患の寄与因子として報告されています。 眼では、血管の不安定性と、網膜および周囲の組織内の体液の蓄積が、血管新生性加齢黄斑変性症 (nAMD) や糖尿病性黄斑浮腫 (DME) など、視覚を脅かす最も一般的な疾患の中心的な特徴です。未治療のまま放置すると急速な視力喪失につながる可能性があります4、5、6、7。 さらに、緑内障 8 やぶどう膜炎 9 などの眼疾患も血管透過性の増加と関連付けられていますが、この病気の病因との関連を定義するにはさらなる研究が必要になる可能性があります。

ラニビズマブやアフリベルセプトなどの抗 VEGF 阻害剤の硝子体内注射は、nAMD および DME の治療における標準治療となっており 10,11、患者の視覚結果に革命をもたらしましたが、これらの疾患は依然として視覚障害の主な原因であり 12、すべての患者が反応するわけではありません。一部の患者は、抗VEGF治療にもかかわらず網膜または網膜下の体液漏出を経験し続けたり、線維症や萎縮を発症したりする可能性があります。 これらの満たされていないニーズの 1 つに対処するために、ファリシマブ (VABYSMO; Genentech/F. Hoffmann-La Roche Ltd.) など、眼の血管の安定性を回復することを目的とした次世代の治療薬が最近市場に参入しました。因子 (VEGF) – アンジオポエチン (Ang)-2 二重特異性抗体 13、14、15。

これらの疾患についての理解が進むにつれて、病的な眼血管漏出を防ぐことができる新しい治療法の開発が続けられています。 これらの新しい治療法の開発を支援するには、血管透過性の変化を経時的に監視できる前臨床モデルとそれぞれの方法が必要です。 現在の透過法には、エバンスブルー 16,17、フルオレセインイソチオシアネート (FITC)-デキストラン 18 およびマイクロスフェア 19 の灌流技術のほか、フルオレセイン血管造影 20,21 や外因性造影漏洩光干渉断層撮影法 (OCT)22 などのイメージングベースの技術が含まれます。 これらの技術の多くは十分に確立されていますが、いくつかの課題や欠点もある可能性があり、それらについては他の場所で詳しく説明されています20。 ここで説明する方法は、既存の技術と組み合わせて使用​​することもできます。

蛍光測光法は、臨床および非臨床の眼科研究現場で長年使用されてきた多用途ツールです 23,24。 蛍光光度計は、眼組織内の蛍光色素の濃度を測定するように設計されており 25、参照色素の拡散と除去を測定し、眼血管系の生理学的状態の指標を提供するために使用できます。 蛍光測光装置は、ヒト 26、ラット 27、28、その他の種 29、30 において、房水の流れ、薬物動態、涙液膜生成、血管漏出などの眼への応用に利用可能でしたが、比較的最近まで 31、限界のためマウスでは使用できませんでした。目の大きさのこと。 この論文では、網膜、硝子体、前房の透過性を測定するための新しい利用可能な技術の使用を検討します。 私たちは、眼疾患の動物モデルでこの技術を検証するとともに、抗VEGF治療後の硝子体透過性の測定にこの技術を使用する方法の例を提供し、治療法開発におけるその可能性を実証します。 これらの発見は、蛍光測光法がマウスの眼の血管漏出の変化を監視および定量化するために利用できる可能性があり、他の既存の方法と並行して使用できる可能性があることを示しています。

マウス蛍光光度計の使用を検証するための最初のステップは、マウスの目の網膜、硝子体、および角膜/前房に対応するスキャンの軸方向の距離を割り当てることでした。 硝子体を検出するために、まず 20 ng のフルオレセインを中央硝子体腔に直接注射し、続いて中央硝子体を通して蛍光光度計で即座に測定しました。 69 と 77 の軸方向ステップの間に鋭いピークが観察されました (図 1a)。 これに続いて、角膜/前房の位置を示すために、同じマウスの目に局所的に 20 ng のフルオレセインを投与しました。 硝子体のピークに加えて、角膜/前房についても 111 と 116 の軸方向ステップの間のピークが確認されました (図 1b)。 2番目のマウスでは、10 ngのフルオレセインを硝子体内（IVT）注射すると（図1c）、20 ngの用量の約半分のサイズの硝子体ピークが生じました（図1b）が、軸方向の距離は同じでした。 これは、フルオレセイン用量に依存しない軸方向距離の再現性、およびIVT注射の用量依存性のピークサイズを実証しました。 ただし、空間解像度の制約により、角膜と前房の測定を分離することはできませんでした。

マウス蛍光光度計からのスキャンで目のさまざまな区画を区別します。 C57Bl/6J マウスの眼に対して蛍光光度計スキャンを実行し、以下のとおりです。 (a) 20 ng のフルオレセインの硝子体内注射、(b) 20 ng のフルオレセインの硝子体内注射、続いて 20 ng のフルオレセインを局所適用、(c) 10 ng のフルオレセインの硝子体内注射、および (d) 125 ng の硝子体内注射70 kDa FITC-デキストランの静脈内注射および2.5 mgの70 kDa FITC-デキストランの静脈内注射（スキャンは別々のマウスで実行され、同じプロット上で結合されました）。 硝子体内注射を硝子体中央部に実施した。 各図のラベルは、各マウスの目の硝子体 (中心)、前房、網膜の位置を示しています。 AC = 前房; IVT = 硝子体内。

硝子体および角膜/前房の同定に続いて、硝子体区画と網膜区画を区別することを試みました。 フルオレセイン（分子量 = 376 Da）に比べてサイズが大きいため、血液網膜関門を通過して網膜から硝子体に拡散することができない 70 kDa FITC-デキストランを使用して、1 匹のマウスに 2.5 mg の FITC-デキストランを静脈内 (IV) 注射しました。デキストランを投与し、125 ng FITC-デキストラン IVT を与えた別のマウスとピークを比較しました。 IV注入されたマウスでは、網膜内のFITC-デキストランの蓄積に対応するピークが軸方向距離51〜55で検出されましたが、IVT投与されたマウスの眼では硝子体ピークが軸方向距離69〜74で検出されました。 両方のトレースを重ね合わせると、網膜区画と硝子体区画の分離が可能であることがわかります（図 1d）。 図 1 で特定された網膜、硝子体、および角膜/前房の光路長は、将来の眼の測定の基準として機能しました。

蛍光測光法によって異なるマウスの目のコンパートメントを特定した後、我々の次の目標は、眼内のフルオレセインの用量レベルの変化を検出するための蛍光測光器の感度を決定することでした。 フルオレセインは以前の複数の研究で選ばれた蛍光色素であり、比較できるため、全身投与されたフルオレセインを使用することにしました。 最初に、フルオレセイン注射の 2 つの全身経路、IV および皮下 (SC) をテストすることを選択しました。 IV 投与には、血液循環への色素の直接投与が可能になるため、追加の吸着変数が導入されないという利点があります。 ただし、私たちの手では、少量を正確に注入するとばらつきが大きくなり、データセットを生成するにはより多くのマウスが必要になる可能性があります(補足図1)。 対照的に、SC 投与 (図 2) では、動物間の眼球測定のばらつきが小さく、蛍光強度に強い変化が生じました。

雌の C57Bl/6J マウスへのフルオレセインの皮下投与後の用量反応および時間経過。 (a) 代表的なスキャン、および (b) 0.25、0.50、および 1.0 mg のフルオレセインを皮下注射したマウスの 30 分後の平均した網膜、硝子体および前房のフルオレセインの定量。 1 mgのフルオレセインを皮下注射した5〜60分後の、C57Bl/6Jマウスの（c）網膜および硝子体、および（d）前房の蛍光レベルを示す時間経過。 (a および b) の用量反応では N = 5 ～ 6 匹のマウス、時間経過 (c および d) では N = 3 匹のマウス。 R = 網膜; V = 硝子体液; AC = 前房; SC = 皮下。

最初の実験では、0.25、0.5、1.0 mg の用量を増加させてフルオレセインを皮下注射し、30 分後に目のスキャンを実行しました。 平均スキャンプロファイル（図2a）に示すように、各コンパートメントで用量依存的なフルオレセインの増加が観察されました。これは、網膜、硝子体、および前房の蛍光シグナルの曲線下面積（AUC）測定によって定量化できます。 (図2b)。 この実験から、図2c、dに示す経時実験用に1 mgの用量を選択しました。これは、この用量がさまざまなマウスの目の区画における蛍光の検出に最適であるためです。

次に、注射後 60 分まで、異なる眼区画におけるフルオレセインの蓄積を 5 分ごとに監視しました。 硝子体 (図 2c) および前房 (図 2d) では、フルオレセインの直線的な上昇が検出されました。 網膜では、フルオレセインレベルはSC注射後約20分で飽和しました（図2c）。 IV投与（補足図1）では、前房および硝子体へのSC投与と比較して同様の傾向が観察されましたが、フルオレセインの網膜レベルは投与後5分でピークに達し、おそらく全身性の上昇により実験の過程で減少しました。クリアランス。

これらの実験の結果として、図３および図４に示すように、その後のすべての実験において、フルオレセインの用量を５０ｍｇ／ｋｇで継続することを決定した。 50 mg/kg の用量は、約 20 g のマウスに対する以前の時間経過実験で使用したフルオレセインの総用量 1 mg に近似します。 体重を調整することで、より一貫したフルオレセイン血漿レベルが保証されます。 さらに、残りの実験では、異なる眼区画内のフルオレセインのレベルを血漿値に正規化し、そのように表しました。

エンドトキシン誘発ブドウ膜炎モデルにおけるマウス蛍光光度計の応用。 LPS (1 ng) または PBS を C57Bl/6J マウスの目に硝子体内注射し、24 時間後に 50 mg/kg のフルオレセインを皮下注射したマウスから蛍光測光、OCT、およびフルオレセイン血管造影を実施しました。 （a）フルオレセイン投与50分後のPBS（左）およびLPS（右）処理マウスの眼からの、代表的なフルオレセイン血管造影（上のパネル）およびOCT画像（下のパネル）。 LPS を注射した眼の OCT 画像の矢印は、硝子体に浸潤している免疫細胞の存在を示しています。 （b – d）蛍光測光法を使用して（b）網膜、（c）硝子体、および（d）前房のフルオレセインレベルを定量化した時間経過により、PBSとLPSの間で網膜と前房のフルオレセインレベルに有意な差がないことが明らかになりました。処理。 しかし、硝子体では、LPS 治療後の 45 分から 60 分の後の時点で有意な増加が観察されました。 (b – d) に示すデータは、フルオレセインの血漿レベルに補正されています。 (e) フルオレセインの血漿レベルは、PBS 治療群と LPS 治療群の間で有意な差はありませんでした。 スケールバー = 500 μm。 N = 1 時点あたり 5 ～ 8 個の目。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、反復測定による二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較を使用。 データは平均値±SEMとして与えられます。 PBS = リン酸緩衝生理食塩水。 LPS = リポ多糖。

蛍光測光法を使用したスト​​レプトゾトシン (STZ) 糖尿病マウス モデルにおける透過性の定量化。 10週間前にSTZで糖尿病になるように誘導されたマウスをこの実験に使用し、年齢を一致させた非糖尿病対照動物と比較した。 (a) 糖尿病誘発後 10 週間の STZ 糖尿病マウスでは血糖値が有意に上昇しましたが、(b) 体重は非糖尿病対照マウスと有意差はありませんでした。 （c）網膜、（d）硝子体、および（e）前房のフルオレセインレベルはすべて、50 mg / kgのフルオレセイン皮下注射後40〜60分のさまざまな時点でSTZマウスで有意に増加しました。非糖尿病対照を使用。 (c–e) に示すデータは、フルオレセインの血漿レベルに補正されています。 (f) フルオレセインの血漿レベルは、STZ 糖尿病マウス治療群と非糖尿病対照マウス治療群の間で有意な差はありませんでした。 N = 1 時点あたり 6 ～ 16 個の目。 血糖値と体重は、反復測定による二元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定によって統計的に評価されました。 眼区画漏出は、反復測定による二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較検定によって統計的に評価されました。 * P < 0.05、** P < 0.01、**** P < 0.0001。 データは平均値±SEMとして与えられます。

JR5558 自然発生 CNV マウス モデルにおける透過性の定量化、および蛍光測光法を使用して測定された抗 VEGF 治療に対する応答。 （a〜c）雄と雌のJR5558マウスと年齢を一致させた対照C57Bl / 6Jマウスに50 mg / kgのフルオレセインを皮下注射し、別の眼区画における血漿に対して補正されたフルオレセインレベルの比率の経時変化を測定しました。 JR5558 マウスは、C57Bl/6J マウスと比較して、(a) 網膜および (b) 硝子体におけるフルオレセイン レベルが有意に増加していました。 (c) 前房と (d) 血漿中のフルオレセインのレベルには有意な差はありませんでした。 （ e – g ）JR5558マウスにベースライン（0日目）と3日目に抗VEGFまたはIgG対照抗体を腹腔内投与し、ベースラインと7日目に蛍光測光法を使用してフルオレセイン漏出を定量しました。循環血漿に対して補正されたフルオレセインのレベルは、フルオレセイン皮下投与の45分後に測定。 (e) 抗 VEGF 治療は、硝子体内のフルオレセインの量をベースライン (f) の約 77% に大幅に減少させましたが、IgG コントロールは有意な効果を持ちませんでした。 （ g ）IgGまたは抗VEGF治療後のベースライン（各治療グループの左パネル）および治療後（各治療グループの右パネル）におけるJR5558マウスの目の代表的なフルオレセイン血管造影画像。 時間経過の場合は N = 3 ～ 6 眼、IgG および抗 VEGF 治療の場合はグループあたり N = 12 眼 スケール バー = 500 μm。 眼区画漏出は、反復測定による二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの多重比較検定によって統計的に評価されました。 ベースラインおよび治療後の補正された硝子体フルオレセイン濃度は、一元配置分散分析とそれに続くニューマン クールの多重比較検定によって評価されました。 対応のない T 検定によって統計的に評価されたベースラインからの変化の割合。 *P < 0.05、**P < 0.01。 データは平均値±SEMとして与えられます。

フルオレセインの投与量と投与経路を選択した後、疾患モデルにおける血管透過性の変化を検出するためのマウス蛍光光度計の適合性をテストし始めました。 私たちが最初に調査したのは、前部ブドウ膜炎のモデルであるエンドトキシン誘発性ブドウ膜炎 (EIU) でした。 エンドトキシン LPS を IVT 注射して炎症と血液網膜関門の破壊を誘発し、24 時間後にフルオレセイン血管造影、OCT、および蛍光測光を実施しました（図 3）。 フルオレセイン眼底血管造影法で観察されたように、LPSによる眼の治療は血管漏出を誘発し、同時に炎症細胞の流入の増加が起こり、これはOCTイメージングで観察できました（図3a）。 並行して、蛍光測光を実施したところ、LPSで処理した動物では、PBSを注射したマウスと比較して、網膜へのフルオレセインの取り込みが15〜25分間遅くなったように見えました（図3b）が、これは有意には達しませんでした。 さらに、前房の場合と同様に、30分以降では、PBS対照グループと比較してフルオレセインレベルに有意差はありませんでした（図3d）。 対照的に、硝子体区画では、LPS処理した眼でより高いレベルのフルオレセインが観察され、これは45分後に有意に達し、60分まで継続しました（P < 0.05;図3c）。 60分後の血漿レベルはLPS群とPBS群の間で有意な差はなかった（図3e）ため、フルオレセインの硝子体レベルの違いは全身曝露の変化とは無関係である可能性が高い。

EIU によるマウス蛍光光度計の検証に続いて、次に STZ 誘発マウス糖尿病モデルに移り、慢性高血糖に関連する血管漏出の変化が観察できるかどうかを確認しました。 糖尿病の誘導後、マウスで高血糖を2週間目に初めて観察しました（データは示されていません）が、STZ注射後少なくとも10週間まで上昇したままでした（図4a）。 動物は、非糖尿病対照マウスおよびＳＴＺ糖尿病マウスの両方で体重増加を続けたが、ＳＴＺ群ではその速度が遅く、有意には達しなかった（図４ｂ）。

蛍光測光法では、フルオレセイン注入後の測定の初期段階で検出レベルが低いことが明らかになったため、検出レベルの一貫性と信頼性が低くなりました。 したがって、注射後の初期の時点を除外し、40 ～ 60 分の測定値のみを含めました。 各眼区画のフルオレセインのレベルは、非糖尿病対照群とは大きく異なりました。 網膜と前房の両方（図4cおよびe）では、非糖尿病対照と比較して、STZ糖尿病マウスではフルオレセインレベルが50分から増加しました。 硝子体では、フルオレセインの有意な上昇が、測定されたすべての時点で明らかでした（図４ｄ）。 STZマウスでは血漿フルオレセインが減少しましたが（図4f）、値は有意に達しませんでした。

最終的な検証実験では、自発性脈絡膜血管新生 (CNV) の JR5558 マウス モデルを使用しました。 JR5558 マウスは、これまでに新規治療薬をテストするための前臨床研究で使用されてきた 34,35 ため、このモデルを使用して、VEGF 中和後の同じ動物の眼における縦方向の透過性の低下をモニタリングしたいと考えました。 最初に、CNV の存在が漏出にどのような影響を与えるかを確認するために、JR5558 マウスと同年齢の C57Bl/6J 対照マウスにおけるフルオレセインの蓄積を比較しました。 これらの実験には、すでに非常によく確立された病変を持っていた生後 13 週目のマウスを使用しました。 網膜では、フルオレセインは、JR5558マウスの皮下投与後45〜55分で増加しましたが（図5a）、60分ではC57BL/6Jと有意な差はありませんでした。 硝子体では、45分から60分の時点でフルオレセインの顕著な上昇が観察されました（図5b）。 前房については、C57Bl/6J マウスと JR5558 マウスの間で有意な変化は観察されず (図 5c)、血漿レベルはマウス系統間で差がありませんでした (図 5d)。

JR5558 マウスにおける CNV 漏出に対する VEGF 中和の効果を調べるために、8 週齢の JR5558 マウスに IgG コントロールまたは抗 VEGF 抗体を腹腔内に 2 回投与しました。 網膜のフルオレセインレベルがあまりにも変動しすぎるため（非常に高いフルオレセインシグナルの点状領域を生じた漏出新生血管病変の存在のため）、前房には新生血管の病理が存在しないため、フルオレセインの蓄積は硝子体でのみ測定されました。 硝子体フルオレセインレベルは、ベースラインでは IgG 群と抗 VEGF 群で有意な差はありませんでした。 治療後、硝子体内のフルオレセインレベルはIgGグループでは変化しませんでしたが、抗VEGFグループではベースラインから25％の大幅な減少がありました（P <0.05;図5e、g）。 個々の動物のベースラインからの変化率を計算したところ、同様の効果が見られ、抗VEGF群では全体で19％減少したのに対し、IgG対照群では7％増加でした（図5f）。 総合すると、これらのデータは、蛍光光度計をマウスで使用して、治療に応じた透過性の変化を長期的に評価できることを示しています。

ここでは、マウスの目の血管透過性の変化を生体内でリアルタイムに測定する方法を示します。 この方法を糖尿病性網膜症、ぶどう膜炎、脈絡膜血管新生のマウスモデルに適用したところ、対照動物と比較して血管漏出の増加が観察されました。 最後の実験では、抗VEGF治療を使用してフルオレセインレベルの上昇を軽減できることを実証し、同じ動物の眼内で治療前と治療後の両方の透過性変化を測定できることを示しました。

他の方法と同様に、成功はテクノロジーを最適に使用するかどうかによって決まります。 マウス蛍光光度計では、多くの要素を考慮する必要があります。 再現可能なデータを一貫してスキャンできるようにするには、蛍光光度計の光学ヘッドとマウスの視軸の中心を正確に位置合わせすることが不可欠です。 機械は光学デバイスであり、集中的な励起と光の放出の検出に基づいているため、視軸にできるだけ干渉がないことが重要です。 当初の問題は、麻酔下では、たとえ定期的に注油していても、マウスの目は白内障を発症する傾向があり、そのため後眼組織のフルオレセインレベルの記録が不可能になることでした。 私たちは、麻酔導入後にマウスの目にコンタクトレンズを適用することで白内障の形成を防ぐことが解決策であることを発見しました。 さらに、コンタクトレンズには、レンズの表面で乾燥した液体（例えば、ＰＢＳ）によって残留物が残らないようにする必要がある。 この問題は、使用前にレンズを超純水ですすぐことで解決できます。

また、明確な視軸を維持することに関連して、この方法は、たとえば硝子体内注射や炎症を引き起こす物質による眼組織への損傷に敏感になる可能性があります。 硝子体内 LPS 投与を用いた実験では、前房における硝子体出血や炎症細胞の発生を最小限に抑えるために、LPS の用量を漸増する必要があり、34 ゲージの鈍針を使用して硝子体内注射を行う必要があることがわかりました。 LPS の異なるバッチ間ではばらつきが観察されたため、可能な限り同一のバッチ番号を使用することが重要でした。 一貫して目を拡張することも不可欠でした。 麻酔後に拡張剤を追加し、各目に同量のトロピカミドを投与しました。

私たちの実験では、フルオレセインを色素としてテストしました。これは、フルオレセインがイメージングや透過性の研究で広く使用されており、マウスで繰り返し使用するのに好ましい安全性プロファイルを備えているためです。 分子量の異なる他の色素は、漏れ依存性の変化を検出するための蛍光測光実験に適している可能性がありますが、現在の原稿の範囲を超えています。 フルオレセインの投与には主に皮下経路を使用しました。これは、静脈内経路と比較して実行が最も簡単で、投与ミスが少なく、シグナル対ノイズが減少することが判明したためです。 もう 1 つの重要な変数は、動物へのフルオレセイン投与のタイミングでした。 おそらく、麻酔下のマウスは静止しており、同様の代謝率を有する可能性があるため、動物に麻酔をかけてから投与すると、結果のばらつきが大幅に減少することがわかりました。

マウス蛍光測光法には、エバンスブルー法やその他の灌流ベースの方法など、透過性を測定する既存の技術に比べて重要な利点があります。 第一に、アッセイを実行するために動物を犠牲にする必要はありません。これは、動物を複数の実験に使用できる可能性があることを意味します。 これは、動物研究における 3R（削減、改良、代替）の実践に役立ちます29。 第二に、反復測定を使用して、同じ動物の血管漏出を縦方向に監視することが可能であるため、研究者は、眼疾患モデルにおける治療前後の効果、または経時的な透過性の進展を計算することができます。 第三に、この方法は、エバンスブルーなどのより確立された透過性の方法と組み合わせて使用​​したり、フルオレセイン血管造影などのイメージング技術と組み合わせたりすることもできます。 さらに、このデバイスはマウスでの使用に適しているため、血液網膜関門の破壊に寄与する要因を探すために、漏出測定とその種の標的遺伝子操作を組み合わせることが可能であることを意味します。 ただし、1 つの欠点は、眼と全身の解剖学的構造と生理学に大きな違いがあるため、人間の研究を含め、種全体で漏洩の絶対値を直接比較しようとする場合、マウスでの結果は注意して受け取る必要があることです。

要約すると、マウス蛍光光度計は明確な視軸を維持できる実験に使用できることをお勧めします。 例えば白内障、前腺腫、硝子体出血などを引き起こす治療や遺伝子変化には、エバンスブルーやその他の灌流ベースの方法などの方法が適している可能性があります。 ただし、視軸が鮮明なままであれば、マウス蛍光測光法を既存の方法と並行して複数の時点で使用でき、眼球画像が有益な場合があるフルオレセイン血管造影などの画像ベースの方法と組み合わせて使用​​できます。 さらに、研究者がデータを灌流ベースの方法と比較したい場合でも、必要に応じて比較することができます。

結論として、私たちはマウス蛍光光度計が基礎研究と創薬の両方にとって非常に有用なツールであると考えています。 滲出性加齢黄斑変性症および糖尿病性黄斑浮腫に対する次世代の治療薬が登場するにつれ、最良のツールを使用することで、新たな経路と相互作用する薬剤の同定に役立ち、体液制御と治療効果の持続性の最適な組み合わせが得られることは明らかです。 。 マウス蛍光光度計は、最適な新規治療法を区別するのに役立つ追加の方法を提供する可能性があります。

表 1 は、研究全体を通じてさまざまな実験に使用された動物の系統、年齢、性別、および供給者に関する情報を示しています。

すべての動物には、12 時間の昼夜サイクル、温度管理された環境で、自由に餌と水を与えました。 動物実験はスイス連邦食品安全獣医局によって承認され（参照BS-2730およびBS-2734）、動物保護と福祉に関するスイス連邦条例および協会の規則に従って実施されました。視覚および眼科研究における動物の使用に関する声明および眼科および視覚研究ガイドラインに準拠しており、ARRIVE ガイドラインに準拠しています。

硝子体内 (IVT) リポ多糖 (LPS) 注射の場合、動物はイソフルラン 3%、O2 100% を使用して麻酔されました。 他のすべての実験では、メデトミジン (Dorbene®、0.5 mg/kg、Graeub AG、ベルン、スイス)、ミダゾラム (5 mg/kg、Roche Pharma AG、Grenzach-Whylen、ドイツ) およびフェンタニルの皮下併用を使用してマウスを麻酔しました。 Curamed®、0.05 mg/kg、Actavis Switzerland AG、レーゲンスドルフ、スイス）。 次に、回復実験のために、ブプレノルフィン（Bupaq®、0.2 mg/kg、Streuli Pharma AG、スイス、ウツナッハ）、アティペマゾール（Alzane®、2.5 mg/kg、Graeub AG、スイス、ベルン）およびフルマゼニルの組み合わせでマウスを拮抗させました。 (Anexate®、0.5 mg/kg、Roche Pharma AG、Grenzach-Whylen、ドイツ)。

IVT 適用前に、LPS (カタログ L6529; Sigma、ザンクトガレン、スイス) の溶液を、-20 °C で保存した凍結アリコートから滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS; Life Technologies、スイス) で調製し、最終濃度は1 ng/1 μl。 動物をイソフルランで麻酔し、局所麻酔薬（Novesin®; OmniVision、スイス）および散瞳薬（Tropicoid 0.5% SDU Faure、Théa Pharma SA、スイス、シャフハウゼン））を滴下した。 目をポビドンヨード 5% (iso-Betadine® 5%、MEDA-Pharma GmbH & Co.KG、バート・ホンブルグ、ドイツ) で洗浄し、続いて滅菌 PBS で洗浄し、次にナノフィル シリンジと接続された 34 ゲージ針 ( NF34BL-2) (両方とも World Precision Instruments International、フリードベルク、ドイツ) 1 μl/眼の LPS または PBS (対照) を注射しました。 最後に、動物を回復のために飼育箱に戻しました。

24 時間後、皮下麻酔を使用してマウスを麻酔し、次にフルオレセイン血管造影 (FA) と網膜および硝子体の眼球干渉断層撮影 (OCT) 画像を撮影して浸潤炎症細胞の存在を確認しました。 イメージング後、マウスは蛍光測光を受けました。

動物を 2 つのグループに分け、ストレプトゾトシン (STZ; 50 mg/kg 体重、7.5 mg/ml、0.05 M クエン酸ナトリウム緩衝液、pH 4.5 で調製) または PBS のいずれかを連続 5 日間腹腔内 (IP) 注射しました。 STZを調製し、投与の少なくとも30分前に冷蔵庫に保管した。 最後のＳＴＺまたはＰＢＳ投与の５日後、ＡｌｐｈａＴｒａｋ血糖モニタリングシステム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ ＵＳＡ、カリフォルニア州アラメダ）およびテストストリップ（Ａｌｐｈａ Ｔｒａｋ２、Ｚｏｅｔｉｓ Ｓｃｈｗｅｉｚ、スイス、チューリッヒ）を使用して、尾静脈穿刺により血糖を測定した。 糖尿病の発症は、血糖値が 14 mmol/L (250 mg/dl) より高いグループとして定義されました。 血糖値が 250 mg/dl 未満の動物には再注射は行わず、研究にも含めなかった。 動物の体重と血糖値は研究全体を通じて監視され、血糖値が継続的に上昇したマウスのみが糖尿病であるとみなされた。 蛍光光度測定の場合、STZ 後 10 週間で動物を測定しました。

研究全体を通して、雄と雌の JR5558 マウス 33 を使用しました。 経時的研究および抗VEGF薬理学的治療研究では、動物はそれぞれ13週齢および8週齢であった。 薬物治療実験では、統計的に等しい（P > 0.05; 対応のない t 検定）病変数を持つ治療群に動物を割り当てるために、マウスは抗体投与の前日の 8 週目にベースラインのフルオレセイン血管造影 (FA)34 および蛍光測光による評価を受けました。異なる眼区画におけるフルオレセイン濃度。 抗ＶＥＧＦ（Ｂ２０－４．１３７）またはＩｇＧ対照抗体をベースラインの１日後に腹腔内投与し、３日後に反復投与した（１ｍｌ／体重１００ｇ、合計２回）。 抗ＶＥＧＦおよびＩｇＧ対照の治療前および治療後の効果を比較するために、初回抗体投与の１週間後にＦＡおよび蛍光測光データを再度収集した。 JR5558 マウスのベースラインおよび治療後の評価では、蛍光測光のために 45 分の時点が選択されました。

蛍光測光測定は、走査型接眼蛍光光度計(Fluorotron Master Research Mouse Edition; OcuMetrics, Inc.、マウンテンビュー、カリフォルニア州)で実施した。 この原稿で使用されるメソッドを説明するより詳細なプロトコルは、補足メソッドのセクションにあります。

実験で測定されたフルオレセイン濃度が直線範囲内にあることを確認するために、フルオレセイン標準曲線を作成しました。 蛍光光度計はフルオレセインをng/ml単位で直接測定できるため、後の実験では標準曲線はフルオレセインレベルの計算には使用されませんでした。 標準曲線は、メーカーから供給されたマイクロキュベットホルダーを使用し、希釈剤として PBS を使用したマイクロキュベット内で実行されました。 この標準曲線を使用すると、フルオレセインの濃度が増加するにつれて直線関係が観察され（R2 > 0.99、図6）、実験で観察されたフルオレセインレベルの変化が濃度依存的な違いによるものであることを示しています。

フルオレセイン標準曲線。 (A) PBS および (B) 血漿中のフルオレセインの標準曲線。 フルオレセイン標準物質を PBS またはマウス血漿で調製し、PBS でさらに希釈した後、マイクロキュベットでフルオレセイン濃度 (ng/ml) を測定しました。 回帰分析が実行され、統計が図のグラフに示されています。

インビボ実験では、皮下麻酔を使用して動物を麻酔しました。 麻酔後、0.5% トロピカミド (Tropicoid 0.5% SDU Faure、Théa Pharma、スイス、シャフハウゼン) で目を拡張し、5 分後にフルオレセイン溶液 (cat 46,960; Sigma-Aldrich、ザンクトガレン、スイス) または FITC-デキストラン 70 kDa ( cat 46,945; Sigma-Aldrich、St Gallen、スイス) を、結果のセクションに記載されている用量で、IV、IVT、または SC のいずれかで投与しました。 最も一貫した結果を得るには、麻酔後にフルオレセインを投与するのが最善であることがわかりました。

フルオレセイン注射後、3.2 mm プラノ コンタクト レンズ (Cantor and Nissel、ノーサンプトンシャー、英国) をマウスの目に配置しました。 コンタクトレンズは、白内障の原因となる乾燥を防ぐために使用されます。 次に、動物を温度制御された (37 °C) ステージに置き、目を光学装置と平行に並べました。 目のスキャンは、各結果セクションに示されている時点で、450 ～ 490 nm の励起と 520 ～ 600 nm の発光検出を使用して、左右の目から記録されました。 目のスキャンには 1 回のスキャンにつき約 20 秒かかりました。

場合によっては、蛍光測光後の尾静脈から血液サンプル (25 μl) を血漿調製 (Microvette CB 300K2E; Sarstedt AG、ドイツ) 用に採取し、スキャンを循環フルオレセインに対して正規化し、投与の潜在的な違いを考慮しました。 血液サンプルを 10,000 × g で 10 分間遠心分離し、得られた血漿 10 μl を遮光したマイクロキュベット (PS Micro Photometer Cuvette 2 ml; LP Italiana、ミラノ、イタリア) 内で 990 μl PBS で希釈し、付属のキュベットホルダーを使用し、450 ～ 490 nm の励起と 520 ～ 600 nm の発光検出を使用する Fluorotron マシン。

蛍光測光測定を定量化するために、生データを txt としてエクスポートしました。 ファイルを作成し、Microsoft Excel を使用してプロットします。 平均曲線下面積 (AUC) は、眼球区画実験によって決定されたように、網膜、硝子体、前房のピークに対応するスキャンの各領域で 5 ステップで計算されました (図 1)。 血漿フルオレセインに対して正規化されていないデータは、フルオレセイン ng/ml ± SEM として表されます。

血漿正規化のために、循環フルオレセインは、二重スキャンの最大ピーク値を平均することによって計算されました。 次いで、生のＡＵＣ平均を血漿値で割ることにより、眼区画内のフルオレセインレベルを血漿フルオレセインに対する比率として表した。 データは、眼区画：血漿フルオレセイン ng/ml の平均 ± SEM 比として表されます。

生データを蛍光光度計から .txt ファイルでエクスポートし、Microsoft Excel (Microsoft Corporation、ワシントン州レドモンド) にコピーしました。 処理と分析は、Excel および GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA) ソフトウェアを使用して実行されました。 2 つのグループのみを統計的に比較するために、対応のない t 検定を使用しました。 3 つ以上のグループの比較には、一元配置 ANOVA とそれに続く Newman Keul の多重比較検定を使用しました。 時間経過データについては、反復測定を伴う二元配置分散分析 ANOVA (アルファ 0.05) とそれに続く多重比較検定を使用しました (詳細については、図の説明を参照)。 異常値は、ショーヴネの基準を使用して統計分析の前に除去され、異常値は平均値の ± 2 × 標準偏差として定義されました。 データは、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、および ****P < 0.0001 の平均 ± SEM として表示されます。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、まず、Fluorotron Master Mouse Edition デバイスのプロトタイプ バージョンの最初の現物貸与だけでなく、技術的なアドバイスと援助にも感謝の意を表したいと思います。 この原稿はデイビッド・シマ教授に捧げます。

眼科発見、医薬品研究および初期開発、ロシュ・イノベーション・センター・バーゼル、F. ホフマン・ラ・ロシュ社、バーゼル、スイス

ナディーン・コール、ジャニナ・トーレ、クリストフ・ウルマー、リチャード・H・フォックストン

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NC: 研究デザイン、データ分析と統計、生体内研究、原稿レビューと執筆。 JT: 研究デザイン、生体内研究、原稿レビューと執筆。 CU: 原稿のレビューと執筆。 RF: 研究デザイン、データ分析と統計、生体内研究、原稿レビューと執筆。 著者全員が原稿をレビューしました。

リチャード・H・フォックストンへの通信。

NC、JT、CU、RF はすべて、これらの実験が行われた時点では F. Hoffmann-La Roche Ltd の従業員でした。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Colé, N.、Thoele, J.、Ullmer, C. 他。 硝子体蛍光測光法を使用したマウスの眼の血管透過性のリアルタイム測定。 Sci Rep 13、9226 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36202-4

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受信日: 2022 年 12 月 7 日

受理日: 2023 年 5 月 31 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36202-4

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